《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Co-detection and genomic characterization of avian rotavirus A, avian orthoreovirus, and chicken megrivirus-C using nontargeted metagenomic surveillance in Indian broiler chickens
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本研究采用非靶向下一代測序技術(shù)，對印度東北部阿薩姆邦肉雞群腸道病毒組進行監(jiān)測，首次在同一糞便樣本中共同檢測并完成基因組特征分析，揭示了禽輪狀病毒A型、禽正呼腸孤病毒和雞巨病毒-C型三種病毒的共存情況。研究通過系統(tǒng)發(fā)育分析和單核苷酸多態(tài)性鑒定，發(fā)現(xiàn)病毒基因組存在重配驅(qū)動的進化特征及非同義突變，為區(qū)域性病毒多樣性監(jiān)測、疫苗策略優(yōu)化和生物安全防控提供了重要基因組基線數(shù)據(jù)。
1 引言
家禽腸道病毒組包含一系列常在亞臨床或共感染狀態(tài)下存在的病毒，對家禽健康監(jiān)測和疾病控制構(gòu)成挑戰(zhàn)。禽輪狀病毒A型和禽正呼腸孤病毒已在全球商業(yè)家禽中造成顯著經(jīng)濟損失，而雞巨病毒-C型雖在家禽腸道病毒組中頻繁檢出，但其致病作用和經(jīng)濟影響仍不明確。這些病毒均具有腸道嗜性，通過糞口途徑傳播，可引起腹瀉、脫水、飼料效率降低等臨床癥狀，尤其影響幼禽。其中，禽輪狀病毒A型是肉雞腸炎和矮小綜合征的主要病因，禽正呼腸孤病毒則可導致全身性感染，表現(xiàn)為病毒性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎和腸道吸收不良，而雞巨病毒-C型則與腸道健康和生長性能受損有關(guān)。病毒共循環(huán)和共感染在家禽中十分常見，可能加劇疾病后果并削弱疫苗反應。
禽輪狀病毒A型屬于Sedoreoviridae科，其分段雙鏈RNA基因組包含11個節(jié)段，編碼六個結(jié)構(gòu)蛋白和多個非結(jié)構(gòu)蛋白。輪狀病毒分類工作組根據(jù)所有11個基因組節(jié)段序列來命名基因型，其遺傳多樣性主要源于共感染病毒株之間的重配以及罕見的節(jié)段內(nèi)重組。禽正呼腸孤病毒屬于Spinareoviridae科，其無包膜病毒顆粒具有雙層衣殼，包裹著10個節(jié)段的雙鏈RNA基因組，編碼8個結(jié)構(gòu)蛋白和4個非結(jié)構(gòu)蛋白。基于σC基因序列變異性，禽正呼腸孤病毒被分為六個公認的基因型簇，S1節(jié)段是重組熱點。雞巨病毒-C型屬于Picornaviridae科，其正義單鏈RNA基因組編碼一個被切割成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的多聚蛋白。其分類基于P1衣殼區(qū)以及2C和3C-D組合區(qū)的氨基酸序列分析，其中基因型C1是全球報告最多、地理分布最廣的。
本研究是更廣泛的基于非靶向下一代測序計劃的一部分，旨在繪制印度、中東、土耳其和非洲地區(qū)禽類病毒病原體圖譜，以生成指導疫苗接種策略、加強生物安全措施的基因組數(shù)據(jù)。在此框架下，我們報告了在印度東北部三個商業(yè)肉雞場的臨床樣本中，上述三種遺傳學上不同的腸道病毒的完整基因組。
2 材料與方法
2.1 采樣地點和雞群信息
樣本采集自印度東北部阿薩姆邦Kamrup Rural地區(qū)的三個商業(yè)肉雞場。采樣時，所有雞群均表現(xiàn)出高死亡率和低于標準的體重。三個農(nóng)場的雞群分別有10.6%、25.4%和14.4%的累計死亡率，且33日齡雞只的體重遠低于區(qū)域標準。尸檢發(fā)現(xiàn)腎臟蒼白腫大、肝臟腫大、輸尿管擴張并有尿酸鹽沉積。
2.2 臨床樣本的收集與實驗室處理
為經(jīng)濟高效地最大化病原體檢測和核酸回收，每個農(nóng)場50只肉雞的泄殖腔拭子被匯集為農(nóng)場水平的混合池。為了安全運輸和保存核酸，將三個池的等體積樣品點在基于濾膜的AniCard上并干燥。隨后使用Kylt?RNA/DNA純化試劑盒提取總核酸，并應用專有的宿主DNA/RNA去除方案以富集病毒RNA。
2.3 下一代測序
提取的RNA進行濃度和質(zhì)量評估后，使用隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。構(gòu)建測序文庫后，在Illumina MiSeq平臺上進行雙端測序。
2.4 序列組裝與注釋
原始測序讀數(shù)進行質(zhì)量修剪和宿主來源讀數(shù)的過濾。剩余的讀數(shù)使用MEGAHIT進行de novo組裝，使用Geneious Prime?軟件進行開放閱讀框和功能基因組元件的注釋。
2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析
使用MAFFT對序列進行比對，并在MEGA X中使用最大似然法推斷系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1000次自舉重復評估關(guān)系的穩(wěn)健性。
2.6 重組分析
使用RDP4軟件中的八種啟發(fā)式重組檢測算法，對印度禽輪狀病毒A型、禽正呼腸孤病毒和雞巨病毒株的重組事件進行評估。
3 結(jié)果
3.1 NGS讀數(shù)的組成和分類學分類
非靶向下一代測序產(chǎn)生了137,968個質(zhì)量過濾后的讀數(shù)對。其中，禽輪狀病毒A型、禽正呼腸孤病毒和雞巨病毒-C型分別占6.41%、5.37%和0.67%。
3.2 雞巨病毒-C型
組裝出完整的雞巨病毒-C型基因組，被命名為ChMeV-C/broiler/IN/A2323728-003/23。該基因組包含5′和3′非翻譯區(qū)、多聚蛋白編碼區(qū)和推測的ORF2。氨基酸比較顯示其與來自多個地理區(qū)域的參考菌株高度相似。在次要病毒群體中檢測到五個非同義單核苷酸多態(tài)性，涉及VP0、VP1、ORF2和RNA依賴性RNA聚合酶3D。基于P1區(qū)和2C與3C-D組合區(qū)的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹將該印度菌株置于MeV-C進化枝內(nèi)，形成了一個獨特的、高支持度的亞系。
3.3 禽正呼腸孤病毒
禽正呼腸孤病毒特異性讀數(shù)被組裝成10個代表完整基因組節(jié)段的gap-free contig，命名為Reo/broiler/IN/A2323728-003/23。基因組節(jié)段長度與已發(fā)表的編碼序列大小一致。在次要病毒群體中發(fā)現(xiàn)了九個非同義單核苷酸多態(tài)性，涉及多個節(jié)段的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。BLASTp分析顯示，大多數(shù)節(jié)段與匈牙利的GCIII菌株高度相似，而S1節(jié)段編碼的p10、p17和σC蛋白則與GCIV菌株聚在一起。基于σC氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析將該印度菌株置于GCIV內(nèi)，與中國和日本菌株形成了一個強支持度的獨立亞群。
3.4 禽輪狀病毒A型
禽輪狀病毒A型特異性讀數(shù)被組裝成11個代表完整基因組節(jié)段的gap-free contig，獲得了高覆蓋深度。根據(jù)輪狀病毒分類工作組的標準，該印度菌株的基因型被鑒定為G19–P[31]–I11–R6–C6–M7–A16–N6–Tx–E10–H8，并被命名為AvRV-A/broiler/IN/A2323728-003/23/G19P[31]。系統(tǒng)發(fā)育分析證實了該菌株的基因型分配。在次要病毒群體中鑒定出八個單核苷酸多態(tài)性，包括三個非同義替換。
3.5 重組分析
使用RDP4未在任何印度禽輪狀病毒A型、禽正呼腸孤病毒或雞巨病毒株的基因組節(jié)段中檢測到可信的節(jié)段內(nèi)重組事件。
4 討論
本研究證實了在印度東北部商業(yè)肉雞群中三種不同腸道病毒的共循環(huán)。盡管檢測到的傳染性法氏囊病病毒主要是淋巴嗜性的，但其同時存在表明雞只暴露于免疫抑制和腸道病原體，這種組合可能加劇易感性并調(diào)節(jié)病毒脫落。雞群水平記錄顯示死亡率升高和生長性能下降，表明在研究的雞群中存在持續(xù)但很大程度上未被識別的病毒傳播。混合取樣雖然成本效益高，但缺乏個體水平的分辨率，無法確定每種病毒對雞群健康的具體貢獻。
這是印度首批完整的雞巨病毒-C1基因組報告之一，為其在全球雞群中的廣泛檢測提供了證據(jù)。在次要等位基因中發(fā)現(xiàn)的非同義突變表明持續(xù)的進化動態(tài)。印度雞巨病毒-C菌株與歐洲、南美和非洲菌株形成獨特亞系的系統(tǒng)發(fā)育位置，表明了全球分布的C1基因型內(nèi)的區(qū)域性多樣化。
印度禽正呼腸孤病毒菌株的基因組特征突出了在集約化商業(yè)家禽系統(tǒng)中禽正呼腸孤病毒進化的復雜性。跨多個基因組節(jié)段的系統(tǒng)發(fā)育不一致表明該印度菌株構(gòu)成了一個基因組鑲嵌體，這可能影響抗原性和毒力，使疫苗設計復雜化。檢測到的九個非同義次要等位基因單核苷酸多態(tài)性可能反映了田間分離株之間新興的功能差異。大多數(shù)獲得許可的禽正呼腸孤病毒疫苗與印度分離株等不同菌株的抗原重疊有限，這強調(diào)了需要根據(jù)區(qū)域信息更新疫苗并加強基因組監(jiān)測。
本研究中鑒定的印度禽輪狀病毒A型菌株的基因型與德國和巴西家禽菌株報告的構(gòu)型相似，表明在地理上分散的禽輪狀病毒A型菌株中存在保守的基因組骨架。然而，幾個節(jié)段（包括NSP3）的系統(tǒng)發(fā)育獨特性可能反映了在其他保守基因型內(nèi)的區(qū)域性多樣化。觀察到的單核苷酸多態(tài)性表明潛在的宿主適應或純化選擇放松。印度禽輪狀病毒A型菌株的遺傳獨特性和進化變化跡象，凸顯了為保障家禽健康而持續(xù)進行區(qū)域性基因組監(jiān)測和疫苗知情干預的必要性。
5 結(jié)論
本研究首次記錄了在經(jīng)歷健康和性能挑戰(zhàn)的印度肉雞群中禽輪狀病毒A型、禽正呼腸孤病毒和雞巨病毒-C型的共循環(huán)和完整基因組分析。即使在接種疫苗的雞群中檢測到遺傳多樣化的腸道病毒，也凸顯了生產(chǎn)系統(tǒng)中病毒循環(huán)的復雜性。觀察到的變異，包括非同義多態(tài)性和不同的系統(tǒng)發(fā)育聚類模式，表明存在具有潛在毒力、宿主適應和疫苗效力影響的持續(xù)微進化。宏基因組非靶向下一代測序仍然是揭示病原體多樣性、表征新興變異和為區(qū)域特異性控制策略提供信息的重要工具。在高密度家禽生產(chǎn)區(qū)持續(xù)進行基因組監(jiān)測對于早期發(fā)現(xiàn)變異和降低疫苗失效風險至關(guān)重要。
