《Applied Microbiology and Biotechnology》：Evaluation of the delivery of an anti-Listeria endolysin via CRISPR-Cas9 engineered probiotic Saccharomyces boulardii
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面對抗生素耐藥性日益嚴重的單核細胞增生李斯特菌感染，研究人員開創性地利用CRISPR-Cas9技術對商用益生菌S. boulardii進行基因工程改造，使其在基因組中穩定整合并分泌噬菌體內溶素Ply511。該研究通過模擬胃腸道消化、簡化腸道菌群（SIHUMI-L）模型以及人體糞便樣本的體外發酵實驗，證實了工程化酵母及其提取物能有效且特異性地抑制李斯特菌，同時減少對腸道共生菌群的影響，為開發靶向性、不干擾微生物組的抗感染新策略提供了概念驗證。
每逢夏秋之際，一些由食物引起的感染便會悄然流行，其中，由單核細胞增生李斯特菌引起的李斯特菌病（Listeriosis）尤為棘手。這種食源性病原體不僅會導致發熱性胃腸炎，還可能入侵中樞神經系統引發腦膜炎，造成嚴重后果甚至死亡。更令人擔憂的是，隨著抗生素在全球的廣泛應用，李斯特菌的耐藥克隆株不斷出現，而抗生素治療本身也可能帶來破壞腸道菌群平衡的副作用。面對這一雙重挑戰，科學家們亟需尋找新的武器，既能精準打擊病原體，又能保護好我們體內寶貴的共生微生物群落。于是，一項發表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上的研究，將目光投向了我們熟悉又陌生的“盟友”——益生菌。
本研究正是為了解決這一難題而展開。研究人員設想，能否將一種高效的“細菌切割器”——噬菌體內溶素（Endolysin，也稱酶性殺菌劑）——裝載到一種安全的“運輸車”上，直接將其遞送到感染發生的“前線”，即我們的腸道？他們選擇的“運輸車”是布拉迪酵母（Saccharomyces boulardii），這是一種已經商業化、常被用來緩解抗生素相關腹瀉的益生酵母，其真核特性使其不受抗生素影響。而他們搭載的“武器”，則是一種名為Ply511的噬菌體內溶素，它對所有血清型的李斯特菌都有活性，且理論上特異性極高，有望在消滅“壞蛋”的同時，不傷及腸道里的“好公民”。
為了開展這項研究，研究者運用了幾個關鍵技術方法。首先，他們采用CRISPR-Cas9基因編輯技術，將編碼Ply511的分泌表達盒以無痕、無抗生素抗性標記的方式，精準整合到布拉迪酵母的三個染色體位點，構建出能穩定分泌活性內溶素的工程菌株。其次，他們建立了一套多層次的體外評估體系：(1) 模擬胃腸道消化實驗：使用INFOGEST標準方法，評估工程化酵母在模擬胃酸、腸液環境中的活性和對李斯特菌的抑制效果；(2) 簡化人類腸道菌群模型（SIHUMI-L）：引入了一個包含七種代表性人類腸道細菌和靶病原體的可控細菌聯盟，用以評估內溶素的特異性；(3) 基于人類糞便樣本的體外腸道發酵模型：采集了三位健康志愿者的糞便，在模擬小腸的微氧環境中，真實評估工程化酵母在復雜腸道菌群競爭下的抗病原體效果。所有實驗中李斯特菌活菌的定量均采用平板計數法，而酵母及腸道菌群成員的定量則通過物種特異性的定量PCR（qPCR）進行。
研究結果部分，作者通過一系列實驗系統地驗證了工程化酵母的效能。
S. boulardii 分泌Ply511并展示酶活性
研究人員成功利用CRISPR-Cas9技術，將包含Sed1啟動子、Sed1分泌信號肽、Ply511編碼序列和Sag1終止子的表達盒整合到布拉迪酵母基因組中。通過在含有熱滅活李斯特菌細胞層的平板上進行點板實驗，他們證實了工程化的布拉迪酵母能夠分泌具有活性的Ply511，在菌落周圍形成透明的水解圈，表明其能夠降解李斯特菌的肽聚糖細胞壁。值得注意的是，與同樣經過改造的釀酒酵母（S. cerevisiae）相比，布拉迪酵母展示的水解圈略小，提示其內溶素的分泌表達水平可能較低。
酵母提取物在SIHUMI群落中特異性抑制李斯特菌
研究者測試了不同酵母菌株的細胞提取物對在簡化腸道菌群（SIHUMI-L）中生長的李斯特菌的影響。結果發現，無論是釀酒酵母還是布拉迪酵母的工程化提取物，都能有效降低李斯特菌的數量。其中，來自工程化釀酒酵母的提取物抗李斯特菌活性最強，可在24小時內將李斯特菌降至檢測限以下。更重要的是，通過qPCR追蹤SIHUMI群落中其他六種細菌的基因組拷貝數，他們發現酵母提取物（無論是否含有Ply511）的添加，并未顯著影響這些共生菌的豐度，證實了Ply511對李斯特菌具有高度的靶向特異性。
工程化酵母在模擬胃腸道消化中保持活性
為了評估全細胞酵母作為口服遞送載體的潛力，研究者在模擬胃液和腸液中，將工程化酵母與李斯特菌在牛奶基質中共培養。經過24小時（2小時模擬胃消化，22小時模擬腸消化）后，工程化的釀酒酵母和布拉迪酵母均能比各自的野生型菌株更顯著地降低李斯特菌的活菌數。這證明工程化酵母能夠在一定程度上耐受胃腸道環境，并在其中釋放具有活性的內溶素，發揮抗病原體作用。
S. boulardii在模擬腸道發酵中展現出抗李斯特菌潛力
在最接近真實腸道環境的實驗——基于人類糞便的體外發酵模型中，結果呈現出更復雜的局面。野生型布拉迪酵母本身就表現出降低李斯特菌負荷的能力，而在兩位捐贈者的糞便樣本中，其效果甚至優于工程化菌株。相比之下，無論是野生型還是工程化的釀酒酵母，似乎未能有效抑制李斯特菌，在某些情況下反而可能促進了其生長。qPCR檢測顯示，所有測試的酵母菌株在48小時發酵期間均能保持代謝活性和生長，表明它們能夠在復雜的腸道微環境中存活。
在研究結論與討論部分，作者總結了本研究的核心發現并探討了其意義與未來方向。本研究成功證明了利用CRISPR-Cas9技術將抗李斯特菌內溶素Ply511遞送系統整合到商用益生菌布拉迪酵母中的可行性。盡管工程化布拉迪酵母在多數體外測試中表現出的抗李斯特菌活性略遜于同樣改造的釀酒酵母（推測可能與表達盒最初為釀酒酵母優化、以及兩菌株在糖基化模式等方面的固有差異有關），但布拉迪酵母本身作為益生菌的優勢不容忽視：其對胃酸的耐受性、在37°C下生長良好的特性、已有的臨床使用歷史以及幫助維持腸道黏膜完整性的能力，都使其成為一個極具潛力的遞送平臺。
研究證實，工程化酵母及其提取物在模擬胃腸道條件下能保留活性，并在簡化的腸道菌群模型中特異性抑制李斯特菌而不干擾其他共生菌，這凸顯了內溶素作為“微生物組友好型”抗菌劑的潛力。這一特性使其在食品工業（如作為特定發酵食品的生物防腐劑）和預防醫學（作為抗生素的輔助或替代療法）領域具有應用前景。從監管角度看，酵母提取物等后生元（Postbiotics）產品可能比活的基因工程微生物更容易獲批。
然而，在更復雜、更具競爭性的人體糞便發酵模型中，工程化酵母的抗李斯特菌增強效果并不顯著。這可能是因為在營養有限、缺氧且微生物競爭激烈的真實腸道環境中，酵母的代謝活性降低，導致內溶素表達量不足以產生決定性的抗菌效果。這提示未來的研究需要進一步優化表達系統，例如開發在腸道壓力條件下（如低氧、低pH）活性更強的啟動子，或采用模塊化工程策略（如VersaTile平臺）組合不同的分泌信號、啟動子和內溶素變體，以篩選出在腸道微環境中表現最優的工程菌株。
綜上所述，這項研究為利用工程化益生菌遞送特異性抗菌蛋白以對抗腸道病原體提供了一個概念驗證平臺。它不僅為解決日益嚴峻的抗生素耐藥性問題提供了新思路，也為開發精準調控腸道微生物組、治療特定感染的下一代生物療法奠定了基礎。隨著技術的進一步優化和對宿主-微生物-工程菌相互作用的深入理解，這類“智能益生菌”有望在未來成為我們對抗感染性疾病的有力工具。
