乳腺癌是全球女性中發(fā)病率最高、癌癥相關(guān)死亡率最高的惡性腫瘤。其中，三陰性乳腺癌（TNBC）是一種高度侵襲性的亞型，占所有乳腺癌的15%–20%，其特點是遠處轉(zhuǎn)移風險高。TNBC的轉(zhuǎn)移過程包括腫瘤細胞從細胞外基質(zhì)（ECM）脫離、局部侵襲與遷移、進入血管或淋巴管、在循環(huán)中存活以及在遠處部位最終形成繼發(fā)性腫瘤等多個步驟。失去與ECM及鄰近細胞的附著會觸發(fā)一種稱為失巢凋亡的程序性細胞死亡。為了在血流中存活并在遠處器官建立轉(zhuǎn)移灶，腫瘤細胞必須發(fā)展出對失巢凋亡的抵抗能力，從而實現(xiàn)錨定非依賴性生長。除了失巢凋亡抵抗，ECM脫離還會誘導一系列非失巢凋亡相關(guān)的變化，例如營養(yǎng)攝取改變、代謝重編程、線粒體自噬誘導以及信號轉(zhuǎn)導通路的重新排列。這些變化會損害細胞活力甚至導致細胞死亡。由于TNBC細胞在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常遭遇ECM脫離，因此，清除ECM脫離的細胞對于提高晚期TNBC患者的生存率至關(guān)重要。

腫瘤代謝重編程是指癌細胞為應對環(huán)境或病理條件而發(fā)生的代謝途徑適應性改變，有助于滿足合成代謝生長需求和推動腫瘤發(fā)展。例如，ECM附著的腫瘤細胞即使在常氧條件下也優(yōu)先利用糖酵解作為其主要葡萄糖代謝途徑，以快速產(chǎn)生能量供腫瘤生長。相比之下，ECM脫離的TNBC細胞表現(xiàn)出葡萄糖攝取減少和活性氧（ROS）水平升高。在這些條件下，磷酸戊糖途徑（PPP）可能取代糖酵解成為主導途徑，生成NADPH以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，這使得ECM脫離的TNBC細胞能夠逃逸死亡。因此，靶向代謝重編程代表了癌癥治療一個有前景的治療途徑。

近年來，天然產(chǎn)物因其易得、低成本、毒性小、副作用有限、產(chǎn)生耐藥性的可能性較低且療效較高，作為癌癥治療的有望藥物而受到關(guān)注。鴉膽子油是從鴉膽子種子中提取的，已用于治療多種疾病，包括癌癥、阿米巴痢疾和瘧疾。Brusatol（BRU）是從鴉膽子油中純化的一種均內(nèi)酯化合物，是油的主要活性成分，已顯示出顯著的抗癌活性。研究表明，BRU的抗癌作用包括促進轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的降解、抑制下游抗氧化基因表達、誘導細胞凋亡，以及抑制腫瘤細胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和侵襲。先前的研究報道，低劑量BRU和虎杖苷聯(lián)合治療能顯著抑制TNBC細胞的生長，同時將毒副作用降至最低。此外，BRU已被證明能逆轉(zhuǎn)多種腫瘤細胞的化療耐藥性，使其對化療藥物敏感，并增強化療效果，包括與紫杉醇聯(lián)合治療TNBC。然而，大多數(shù)關(guān)于BRU的研究都是在ECM附著的細胞上進行的，關(guān)于其對腫瘤代謝和遠處轉(zhuǎn)移影響的研究有限。

本研究表明，BRU通過誘導深刻的代謝重編程來抑制TNBC轉(zhuǎn)移。從機制上講，BRU在體外下調(diào)了PPP通量，減少了NADPH的產(chǎn)生，并促進了ECM脫離的TNBC細胞的死亡。在體內(nèi)，BRU顯著抑制了ECM脫離腫瘤細胞的定植，并抑制了其在小鼠模型中的生長。這些發(fā)現(xiàn)為BRU的治療潛力提供了新的見解，并為TNBC的治療提出了新方向。

本研究使用的試劑包括從MedChemExpress購買的純度99.89%的Brusatol（HY-19543），以及多種細胞培養(yǎng)、檢測試劑和抗體。實驗使用了人乳腺癌MDA-MB-231細胞和BT-549細胞。為模擬ECM脫離狀態(tài)，使用聚羥乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被培養(yǎng)板。

研究方法涵蓋多個方面：

Brusatol（BRU）已被證明能抑制ECM附著條件下癌細胞的增殖。本研究使用poly-HEMA包被板模擬ECM脫離。LDH釋放實驗和臺盼藍染色均顯示，與ECM附著細胞相比，MDA-MB-231脫離細胞的LDH釋放和細胞死亡增加。值得注意的是，BRU處理以濃度依賴性方式進一步增強了基質(zhì)脫離細胞的細胞外LDH活性。臺盼藍染色顯示，BRU顯著增加了ECM脫離細胞的死亡率，但在ECM附著條件下與DMSO處理組無明顯差異。此外，DMSO處理本身在ECM脫離條件下也導致比附著條件下更高的細胞死亡，這表明細胞在基質(zhì)脫離后具有固有的脆弱性。

為深入研究BRU的影響，我們檢查了腫瘤球體的形態(tài)特征并評估了3D腫瘤培養(yǎng)中的細胞活力。在前3天，BRU處理的球體比對照組大，表明細胞間未能形成適當?shù)倪B接。隨后，BRU處理抑制了腫瘤球體的生長。到第6天，BRU處理球體的細胞活力比對照組降低了40-50%。總之，這些結(jié)果表明BRU在ECM脫離條件下促進了TNBC細胞的死亡并抑制其增殖。

鑒于BRU能促進懸浮TNBC細胞的死亡，我們進一步評估了其體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移效果。通過尾靜脈注射表達熒光素酶的MDA-MB-231細胞構(gòu)建小鼠肺轉(zhuǎn)移模型。注射后，小鼠隨機分為兩組，在整個研究期間腹腔注射DMSO或BRU（2 mg/kg）共六次。使用IVIS系統(tǒng)每10天進行一次異種移植物的生物發(fā)光成像。在第1天，對照組的生物發(fā)光信號比BRU處理組高12倍。到第10天，這種差異減小，對照組信號高2倍，表明BRU延遲了ECM脫離細胞在肺部的定植。到第20天和第30天，BRU處理顯著抑制了肺部定植腫瘤的生長。

接下來，我們?nèi)〕鲂∈蠓闻K進行離體生物發(fā)光實驗。定量分析顯示，與對照組相比，BRU處理組的發(fā)光信號減少了80%。重要的是，在治療期間，BRU處理的小鼠體重沒有顯著下降，表明在本研究范圍內(nèi)BRU耐受性良好。此外，肺組織學分析顯示，對照組形成了許多大的轉(zhuǎn)移性病灶，而BRU處理組的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少且體積更小。后期時間點生物發(fā)光信號的持續(xù)抑制以及肺結(jié)節(jié)數(shù)量和面積的減少表明，BRU不僅減少了循環(huán)腫瘤細胞的初始負荷，還阻礙了ECM脫離細胞在肺部的定植。總之，這些發(fā)現(xiàn)證明BRU在體內(nèi)有效抑制了TNBC轉(zhuǎn)移。

為研究BRU影響的代謝途徑，對懸浮培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞進行了基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）的代謝組學分析。已知ECM脫離會導致葡萄糖攝取大幅減少，而BRU處理進一步加劇了這種減少。值得注意的是，代謝組學分析顯示，BRU處理后，PPP（變化最明顯）、糖酵解和三羧酸（TCA）循環(huán)的中間代謝物水平顯著下降，包括D-葡萄糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸、D-木酮糖-5-磷酸和3-磷酸甘油酸。

有趣的是，BRU處理導致了D-赤蘚糖-4-磷酸和乳酸的積累。同時，BRU處理后細胞內(nèi)乙酰輔酶A水平降低，表明脂肪酸氧化也受到抑制。盡管作為核苷酸前體的核糖-5-磷酸減少，但流向核苷酸合成的代謝通量卻升高，這可能是代償性重編程的結(jié)果。此外，氨基酸水平，特別是谷氨酰胺，顯著增加。谷氨酰胺代謝為氨基酸和核苷酸生物合成提供氮源，并作為碳源補充TCA循環(huán)，增強了TNBC細胞的耐受性。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，BRU在ECM脫離時廣泛影響代謝重編程，特別是通過抑制PPP。

鑒于代謝物水平的降低可能與PPP和糖酵解中的酶有關(guān)，我們使用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）進一步評估了這些途徑中關(guān)鍵酶的mRNA表達。正如預期，與ECM附著細胞相比，ECM脫離的MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出大多數(shù)酶的mRNA水平更高。BRU處理僅引起ECM附著細胞mRNA水平的微小變化。值得注意的是，在ECM附著細胞中，BRU下調(diào)了幾種糖酵解相關(guān)酶，而在ECM脫離細胞中，這種抑制作用更全面且更明顯。有趣的是，除HK2外，PPP相關(guān)酶的mRNA水平在BRU刺激下普遍升高。總之，BRU在代謝壓力下廣泛抑制了ECM脫離細胞的糖酵解能力，損害了其滿足基本能量和生存需求的能力，從而促進了BRU誘導的ECM脫離細胞死亡。

為闡明BRU影響ECM脫離細胞中PPP的機制，我們接下來評估了其對NADPH水平和NADPH/NADP⁺比率的影響。正如預期，DMSO處理的ECM脫離MDA-MB-231細胞與附著細胞相比，表現(xiàn)出顯著升高的NADPH水平和NADPH/NADP⁺比率。BRU特異性地逆轉(zhuǎn)了ECM脫離細胞中的這種適應，顯著降低了NADPH水平和NADPH/NADP⁺比率，而對附著細胞影響甚微。BRU誘導的這種主要細胞還原劑的耗竭促使我們評估功能性氧化還原狀態(tài)。我們使用DCFH-DA進行流式細胞術(shù)測量ROS水平，結(jié)果顯示BRU處理特異性地觸發(fā)了MDA-MB-231細胞和BT-549細胞的ECM脫離細胞內(nèi)ROS水平的顯著增加，而在ECM附著細胞中無明顯變化。這些數(shù)據(jù)直接將PPP抑制和NADPH耗竭與靶細胞中的氧化還原應激聯(lián)系起來。這些發(fā)現(xiàn)表明BRU加劇了ECM脫離TNBC細胞的氧化還原應激，從而促進細胞死亡并抑制轉(zhuǎn)移。

作為PPP中的限速酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）從NADP⁺再生NADPH，并通過短期和長期機制調(diào)節(jié)氧化應激。先前研究表明，Nrf2在ECM脫離條件下通過下調(diào)TAP73促進G6PD表達。然而，在我們的研究中，Nrf2抑制劑BRU并未降低G6PD的mRNA水平。因此，我們評估了ECM附著和脫離條件下的G6PD蛋白水平。蛋白質(zhì)免疫印跡分析和光密度定量表明，在MDA-MB-231和BT-549細胞中，無論是附著還是脫離條件，BRU處理后G6PD蛋白水平均下降。值得注意的是，在ECM脫離細胞中，特別是在100 nM濃度下，觀察到G6PD蛋白的下降趨勢。這表明BRU對PPP活性和NADPH生成的抑制可能部分歸因于G6PD表達的減少。總之，這些發(fā)現(xiàn)證明BRU通過抑制PPP和耗竭NADPH，破壞了ECM脫離TNBC細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導致致命的氧化應激。雖然在脫離細胞中較高濃度的BRU導致G6PD蛋白減少，但同時G6PD mRNA的上調(diào)表明轉(zhuǎn)錄抑制并非PPP抑制的唯一驅(qū)動因素。因此，該機制可能涉及對G6PD蛋白豐度的部分限制以及對其酶活性的直接或翻譯后抑制的結(jié)合，而非純粹的基于表達的PPP抑制。

過去幾十年，中藥和天然化合物因其低成本、毒性小、能夠逆轉(zhuǎn)耐藥性以及有前景的抗腫瘤功效，在癌癥治療中受到廣泛關(guān)注。白藜蘆醇、莪術(shù)醇、人參皂苷和BRU等草本提取物已在多種癌癥治療中顯示出顯著的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用。然而，大多數(shù)研究都集中在EMT、腫瘤細胞侵襲和遷移上。在本研究中，我們研究了BRU在ECM脫離條件下（轉(zhuǎn)移過程中的持續(xù)狀態(tài)）的抗腫瘤作用。我們的研究結(jié)果表明，BRU顯著促進懸浮細胞的死亡，延遲循環(huán)腫瘤細胞的定植并抑制TNBC轉(zhuǎn)移。正如我們的體外發(fā)現(xiàn)所支持，后期時間點持續(xù)且增強的抑制，以及肺結(jié)節(jié)數(shù)量和面積的減少，表明BRU也損害了早期建立的微轉(zhuǎn)移灶的存活或漸進性生長。這表明BRU靶向的PPP依賴性所賦予的代謝脆弱性可能在腫瘤細胞定植的初始階段持續(xù)存在。值得注意的是，我們探索了BRU對腫瘤細胞代謝的影響，通過靶向代謝為BRU在腫瘤轉(zhuǎn)移中的應用提供了依據(jù)。

活性氧（ROS）是有氧代謝的副產(chǎn)物，在信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要作用。然而，過量的ROS水平會損傷DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)甚至細胞器，最終導致細胞死亡。越來越多的證據(jù)表明，由于內(nèi)在和外在因素（如缺氧、過氧化物酶體功能障礙和錨定非依賴性生長），腫瘤細胞會產(chǎn)生過量的ROS。在原發(fā)部位的快速增殖過程中，尤其是在轉(zhuǎn)移過程中，ECM脫離的腫瘤細胞依賴多種防御系統(tǒng)將ROS水平維持在致死閾值以下。這些系統(tǒng)包括谷胱甘肽和過氧化還原蛋白途徑，其中NADPH是通用的還原當量。基于這些見解，我們推測BRU通過抑制NADPH生成、損害抗氧化防御和升高ROS水平來促進EMC脫離的TNBC細胞死亡。

Nrf2是氧化應激反應的主要調(diào)節(jié)因子，可激活多種抗氧化和解毒基因的表達，包括G6PD、IDH1/IDH2。研究表明，Nrf2抑制可通過下調(diào)糖酵解相關(guān)基因（如GLUT1、HK2、LDHA和PDK1）來抑制糖酵解。在急性髓系白血病（AML）中，已有報道稱BRU通過抑制糖酵解和G6PD引發(fā)抗AML效應。同樣，張等人證明在乳腺癌細胞中抑制Nrf2可降低G6PD表達，抑制PPP，并抑制腫瘤增殖和遷移。相比之下，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在ECM脫離條件下BRU處理并未降低G6PD的mRNA水平，但降低了其蛋白水平，這表明G6PD的調(diào)控可能涉及替代途徑。因此，我們假設(shè)BRU在ECM脫離TNBC細胞中對PPP的抑制主要依賴于葡萄糖攝取的減少。

盡管靶向改變的腫瘤代謝是癌癥治療的一種新興策略，但其在過去十年的治療進展有限。例如，2-脫氧葡萄糖（2-DG）是一種葡萄糖類似物和糖酵解中己糖激酶2（HK2）的競爭性抑制劑，可阻止葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸（G6P），導致ATP耗竭和細胞死亡。雖然2-DG在臨床前研究中顯示出有希望的結(jié)果，并進入治療實體瘤和激素難治性前列腺癌的I/II期臨床試驗，但由于其抑制腫瘤生長的療效有限且毒性顯著，最終開發(fā)被中止。這些挑戰(zhàn)突顯了需要更有效靶向腫瘤代謝的新型藥物。

在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)BRU能顯著抑制ECM脫離TNBC細胞中PPP、糖酵解和TCA循環(huán)的通量，同時誘導谷氨酰胺代謝和ATP水平的代償性增加。這一觀察結(jié)果與先前的研究一致，即單獨靶向葡萄糖代謝會驅(qū)動腫瘤細胞越來越依賴谷氨酰胺分解來生存。這種代謝可塑性是由癌細胞固有的遺傳和表觀遺傳不穩(wěn)定性驅(qū)動的，這使它們能夠快速適應代謝壓力。盡管BRU抑制了PPP、糖酵解和TCA循環(huán)，但ECM脫離TNBC細胞的死亡程度對于癌癥治療而言仍然不足。最近的研究表明，同時使用CB-839阻斷谷氨酰胺代謝和使用3-BP抑制糖酵解能有效減少腫瘤病灶，而單獨使用任一種藥物則不能。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們提出將BRU與谷氨酰胺分解抑制劑聯(lián)合使用，可能會增強其靶向TNBC代謝的治療效果。這種聯(lián)合策略可能有助于克服腫瘤細胞的代謝適應性并改善治療結(jié)果。

需要指出的是，本研究存在一定的局限性。體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗采用的樣本量較小（每組n=3）。雖然在我們的初步研究中觀察到BRU顯著的抗轉(zhuǎn)移效應，但未來需要更大規(guī)模的動物隊列研究，以進一步探索BRU在轉(zhuǎn)移性TNBC中的治療窗口和潛在聯(lián)合策略。本研究的一個局限性是，肺轉(zhuǎn)移灶是基于H&E染色切片中的組織學形態(tài)進行定量的。盡管實驗模型強烈支持這些病灶來源于人類腫瘤，但未來使用人類特異性標志物的免疫組織化學研究可以提供更精確的定量。

總之，本研究證明BRU通過改變代謝重編程來抑制TNBC轉(zhuǎn)移，包括抑制糖酵解、PPP和TCA循環(huán)。這些發(fā)現(xiàn)突出了BRU作為靶向代謝療法有前景藥物的潛力，并表明其與谷氨酰胺分解抑制劑聯(lián)合使用可能會進一步提高治療效果。

在我們的研究中，我們證明天然化合物Brusatol（BRU）通過限制葡萄糖-6-磷酸（G6P），導致依賴磷酸戊糖途徑（PPP）的脫離細胞陷入底物饑餓。盡管細胞試圖通過上調(diào)關(guān)鍵PPP酶（如G6PD和6PGD）的表達來補償，但這種反應最終失敗，導致NADPH耗竭、活性氧（ROS）積累和不可逆的氧化應激。這些發(fā)現(xiàn)表明，BRU通過代謝重編程、耗竭NADPH，從而破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)，誘導ECM脫離TNBC細胞死亡，并抑制其轉(zhuǎn)移潛力。因此，我們的研究表明BRU是轉(zhuǎn)移性乳腺癌一種有前景的治療藥物，同時也為對抗轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療提供了新的機制見解。