雜交優勢或雜種優勢，描述了雜交種相對于其親本系表現出的增強的表型性能。自20世紀初的先鋒性工作以來，玉米一直是雜種優勢研究和利用的模式系統。如今，大多數玉米栽培品種都是雜交種，占全球谷物總產量的35%以上。盡管雜種優勢在植物育種中取得了廣泛成功，但其遺傳基礎長期以來一直存在爭議。最近的群體遺傳分析表明，顯性、超顯性和上位性效應共同促成了雜種優勢。然而，雜種優勢的潛在分子機制仍然是一個謎，尚未完全闡明。

在轉錄組水平上，所有可能的基因表達模式，包括加性、顯性、低顯性和超顯性，廣泛存在于玉米雜交種中。這些顯性或超顯性基因表達模式與經典遺傳模型沒有直接聯系，但非加性基因表達可以部分解釋雜交種的雜種優勢變異。雜交種中基因表達模式的互補可能導致與任一近交親本相比，產生數百個額外表達的基因。這種單親表達（SPE）互補被假設有利于雜交種的發育可塑性和環境適應性。此外，雜交種中同一基因的等位基因在轉錄水平上表達不平衡的現象被定義為等位基因特異性表達（ASE），這可能有助于表型變異，并構成雜種優勢的遺傳基礎。然而，這些研究中的一個主要挑戰是這些基因表達模式尚未與雜種優勢表型相關聯。

在過去的60年里，玉米產量的增加在很大程度上依賴于單交雜交種的育種。現代玉米育種過程中期望性狀的遺傳增益以及潛在的遺傳或基因組變化已被表征。改進的生物和非生物脅迫耐受性，例如對更高種植密度的適應，是產量增長的關鍵貢獻因素。此外，有害遺傳變異在決定表型變異模式和雜種優勢方面起著重要作用。有害等位基因的逐步清除和遺傳負荷的減少已被確定為促成育種成功的關鍵因素。然而，盡管取得了這些進展，關于雜交種中有害變異等位基因特異性調控如何影響表型變異和育種進展，我們的理解仍然不完整。

本研究對中國玉米育種史上具有里程碑意義的雜交種及其親本自交系進行了全面的轉錄組分析。我們的研究揭示了雜種優勢分子基礎的基本見解。首先，我們觀察到基因表達模式的權衡，與親本相比，雜交種持續上調與光合作用相關的基因，同時下調脅迫響應通路。其次，等位基因特異性表達分析表明，現代育種逐步增強了對有害等位基因的抑制，并且這種等位基因表達模式在雜交育種過程中顯示出選擇特征。最后，我們建立了雜種優勢與轉錄組可塑性之間的關聯，后者通過基于熵的基因表達協調性指標在不同條件下進行量化。

為了評估玉米雜交育種背后的基因表達動態，我們對20個具有歷史意義的單交雜交種及相應的親本自交系進行了轉錄組分析。這些親本自交系被歸類為六個雜種優勢群。表型分析顯示，與產量相關的性狀，包括小區籽粒產量、穗粒重、穗粒數和生物量產量，表現出最高水平的雜種優勢。在不同種植密度下，小區籽粒產量的遺傳增益為48.073至55.655 kg/ha·年，其中雜種優勢貢獻了24.474至40.380 kg/ha·年的小區籽粒產量。相對于中親值的雜種優勢百分比在育種期間沒有顯著增加，這在很大程度上歸因于親本系性能的同步提高。然而，雜種優勢百分比始終保持在較高水平（標志性雜交種平均為60.2%）。這些結果共同表明，現代育種取得了雙重成功：提高了親本系的性能，并有效利用了雜種優勢來推動產量提升。

為了調查這一育種過程中的轉錄組變化，雜交種和親本自交系在120，000株/公頃的高種植密度（HPD）和33，000株/公頃的低種植密度（LPD）下種植。我們在三個發育階段收集葉片樣本進行RNA測序。多維尺度分析和主成分分析顯示，轉錄組主要按發育階段聚類，強調了在基因表達分析中采用動態分析方法的重要性。當比較每個雜交種及其相應自交系的轉錄組時，MDS和PCA清晰地暗示了基因型之間的譜系關系。具體而言，雜交種的轉錄組始終位于其親本系之間。

為了表征雜交種和親本自交系在不同種植密度處理下群體水平的基因表達變化，我們應用了多因素差異表達（DE）基因分析。當比較HPD與LPD時，我們在雜交種中鑒定出4843個DE基因，在親本自交系中鑒定出2498個DE基因。值得注意的是，雜交種與親本之間出現了數量多得多的DE基因（11，796個）。為了進一步探索這些DE基因的功能相關性，我們進行了基于基因本體（GO）的基因集富集分析（GSEA）。一個有趣的發現是，雜交種與親本系之間的DE基因在光合作用相關功能類別中富集于上調，而在脅迫響應相關的GO術語中富集于下調。這種模式暗示了繁殖能力和脅迫防御機制之間的關鍵權衡，支撐了雜交種觀察到的優異活力。

我們進一步研究了雜交種和親本系中267個光合作用相關基因和2375個脅迫響應基因在不同發育階段的表達模式。分析揭示了這些功能類別中一致的差異表達模式。與自交親本相比，光合作用相關基因在雜交種中主要上調，而脅迫響應基因則傾向于下調。這種反向調節在多個發育階段觀察到，相當大比例的光合作用相關差異表達基因（59.8%–78.6%）在雜交種中表現上調，而脅迫響應基因（67.5%–70.2%）則表現下調。

我們研究了雜交種中單親表達（SPE）基因的表達互補。在所有親本系中，我們鑒定了14，127個表達基因、7405個沉默基因和10，789個具有基因型依賴性表達的基因。雜交種顯示出類似的趨勢。關鍵的是，親本對平均含有979.9個SPE基因，其中56.9%（平均557.3個基因）在雜交種中表現出互補表達。此外，平均只有13.9個基因在雜交種中獨特表達，而在雙親中都不存在。SPE基因的互補使雜交種能夠表達比其親本更多的基因，這一現象在所有基因型中一致觀察到。此外，DE基因和SPE基因的數量與所有自交系以及雜交種親本對的遺傳距離呈正相關。

我們進一步表征了雜交種及其親本系之間的加性和非加性基因表達模式。優勢/加性比值的密度分布分析表明，大多數基因在雜交種中表現出加性表達。定量上，中親加性表達平均占親本DE基因的55.0%。顯性表達占親本DE基因的32.5%，包括18.3%的高親顯性和14.1%的低親顯性。部分顯性占9.6%，而過顯性表達模式相對罕見（1.4%高于高親和1.6%低于低親）。加性和非加性表達基因的比例在不同發育階段、種植密度處理和基因型中表現出相似的分布。重要的是，GO GSEA顯示，在LPD下15/20的雜交種和HPD下19/20的雜交種中，光合作用相關類別在高親過顯性基因中富集。這一結果與雜交種和親本系之間光合作用相關基因的上調一致。

等位基因特異性表達（ASE）已成為促成雜交種表型多樣性和雜種優勢的重要調控機制。我們采用貝葉斯廣義線性混合模型框架，全面表征了不同遺傳背景和環境條件下的ASE模式。共使用了14，345個SNP用于ASE分析。該方法鑒定出2857個顯著ASE SNP，涵蓋1654個基因。基因本體分析顯示，在表現出ASE的基因中，脅迫響應通路顯著富集，包括幾個先前表征的脅迫耐受相關基因。此外，光合作用的功能類別在ASE基因中也顯示出顯著富集。

現代玉米育種有效地降低了有害變異的頻率，而這些稀有等位基因與表達失調和表型變異相關。我們的分析表明，SNP的ASE比率與相應的等位基因頻率呈正相關，反映了攜帶稀有變異的等位基因在玉米雜交種中表達較低。比較分析顯示，具有顯著ASE的SNP表現出比非ASE SNP更高的等位基因頻率相關性。低頻變異（MAF < 0.1）表現出顯著ASE的比例（63.2%）是常見變異（MAF > 0.1， 17.5%）的3.6倍。為了評估變異有害性如何影響等位基因調控，我們使用SnpEff注釋對SNP的預測突變效應進行分類。結果顯示，33.3%被預測具有大突變效應的SNP表現出顯著的ASE，這比具有中度、低度或修飾效應的SNP觀察到的比例高1.6倍。

先前的一項研究已經確定了1017個在現代育種選擇過程中，在雌性和雄性雜種優勢群中顯示出同向或反向等位基因頻率變化的基因。我們將顯著的ASE基因與這1017個同向或反向選擇的基因進行比較，確定30個ASE基因的等位基因頻率是同向變化的，13個ASE基因在雌性和雄性雜種優勢群之間是同向變化的，13個ASE基因僅在雄性雜種優勢群中發生趨同變化。值得注意的是，這些ASE基因包括發育調節因子，如RLD1（一種控制葉角結構的HD-ZIP III轉錄因子）和根發育調節因子，我們觀察到其具有顯著的ASE以及雜種優勢群中的同向頻率變化。ZmMIPS1表現出顯著的ASE，并僅在雄性雜種優勢群中顯示趨同變化，其同源基因AtMIPS1對生長和開花至關重要。這些發現表明，ASE基因參與了生長和脅迫耐受的生物學功能。

為了進一步探索每個雜交種中的ASE基因，我們采用基于單倍型定相的流程，根據基因水平的雜合變異來量化母本和父本單倍型表達。在雜交種中，22.4%–38.3%的分析基因表現出顯著的親本等位基因表達不平衡。雜交種ASE與親本DE之間的比較分析表明，親本DE基因在雜交種中表現出ASE的可能性更高。并且雜交種中ASE基因的比例隨著親本DE基因倍數變化的增強而增加。雜交種中的這些等位基因表達差異暗示了潛在的順式調控差異。為了驗證這一點，我們檢查了等位基因表達不平衡和平衡基因的順式調控區域中的遺傳變異。值得注意的是，具有顯著ASE的基因在其順式調控區域中比平衡表達基因多出1.14至1.37倍的遺傳變異。

我們隨后應用貝葉斯信息準則模型來闡明雜交種中ASE和親本中DE的調控模式。我們的分析顯示，19.4%的親本DE基因在雜交種中表現出順式調控模式，其等位基因表達比率與親本比例相似。相反，15.0%的親本DE基因在雜交種中表現出平衡的等位基因表達，這表明是反式作用調控。大多數（55.4%）顯示出順式和反式調控效應的組合。然而，10.2%的親本DE基因被歸為意外模式，其中雜交種中的等位基因偏向與親本中的方向完全相反。

為了研究環境對雜交種中等位基因特異性表達的影響，我們檢查了等位基因表達偏向是否會在種植密度處理之間發生轉變。值得注意的是，51.8%的ASE基因在LPD和HPD下都保持一致的親本表達偏向。而22.6%和24.2%的ASE基因分別在LPD或HPD下表現出獨特的ASE。只有1.4%的ASE基因在LPD和HPD之間顯示出ASE方向的轉變。

我們接下來通過分析等位基因特異性表達變化來研究每個親本等位基因對雜交種中種植密度脅迫的響應方式。根據雌性或雄性等位基因在不同種植密度脅迫之間的表達倍數變化，將基因分配到不同的響應模式中。大多數脅迫響應基因（66.4%）表現出單等位基因響應，包括幾乎相等比例的雌性（32.6%）和雄性（33.8%）等位基因特異性響應。在29.6%的基因中觀察到協同響應，其中兩個等位基因顯示出相同方向的表達變化。而一小部分基因（4.0%）表現出拮抗響應，親本等位基因之間的表達變化相反。

有害變異的清除代表了玉米育種改良背后分子基礎的基本原理。有害等位基因的互補在雜交種的優異表型性能中起著重要作用。我們研究了經歷數十年育種選擇的雜交玉米系中有害等位基因和表達模式的變化。我們的分析揭示了雜交種中有害等位基因總數隨育種歷史呈下降趨勢。相反，我們觀察到雜交種釋放年份與互補有害等位基因數量之間存在正相關關系，互補有害等位基因被定義為在一個親本等位基因中攜帶有害變異而在另一個中沒有的基因。表型分析表明，籽粒產量往往與互補有害等位基因數量呈正相關，而與有害等位基因總數呈弱負相關。這些結果共同表明，育種選擇趨勢是減少有害等位基因負荷并增加這些位點的雜合度。

有害變異的轉錄抑制可能代表了對抗其有害表型效應的重要保護機制。我們對互補有害等位基因對的分析顯示，43.6%–62.6%的這些對表現出有害等位基因抑制，其特征是功能等位基因相對于其有害對應物的表達更高。值得注意的是，受抑制的有害等位基因比例與雜交種釋放年份呈顯著正相關，表明現代育種選擇不僅消除或互補有害變異，而且還優先維持其低表達水平。重要的是，這種抑制現象與小區籽粒產量呈正相關，表明其與優良雜交種產量提升的功能相關性。

我們關于有害等位基因抑制的發現暗示了順式調控機制在雜交種改良中的作用。為了評估在育種過程中，順式調控區域是否比編碼序列受到更強的選擇壓力，我們使用基因組進化速率譜分析了互補的有害變異。比較分析顯示，順式調控區域中互補有害變異的積累與雜交種釋放年份、小區籽粒產量以及小區籽粒產量的雜種優勢的相關性比CDS區域更強。我們進一步進行了eGWAS分析，并鑒定了與19，208個基因相關的3，572，171個順式-eQTNs。這些順式-eQTNs在不同雜種優勢群的育種選擇特征中顯著富集。這些結果證明了在玉米育種改良過程中，順式調控元件受到了優先選擇。

我們假設雜交種的優異適應性與其基因調控網絡增強的動力學或可塑性相關。受薛定諤“負熵”作為基本生命原理概念的啟發，我們應用香農熵分析來評估轉錄組動力學。玉米雜交種表現出比其親本自交系顯著更低的轉錄組熵。雜交種轉錄組中觀察到的香農熵降低表明，在不同發育階段和種植密度下，基因表達分布更不均勻、更具結構性。在信息論的背景下，這種較低的熵表明了一種更高有序度和更低隨機性的狀態，我們將其解釋為一種更協調、可能更靈活的轉錄組配置，能夠對不同的生長條件進行優化響應。重要的是，熵減少的程度與關鍵農藝性狀的雜種優勢水平呈正相關，包括小區籽粒產量、粒重、粒數和生物量產量。這種現象不僅限于玉米，對擬南芥雜交種（Col-0 × Per-1）的分析同樣顯示，與親本生態型相比，幼苗發育期間的轉錄組熵降低，支持了植物雜交種中轉錄可塑性的保守機制。

為了驗證雜交種中增強的轉錄組動力學，我們對不同種植密度和發育階段下的共表達網絡進行了層次聚類分析。雜交種表現出比其親本系顯著更多的共表達簇，表明轉錄靈活性增強。我們進一步構建了基因調控網絡（GRN）來檢查轉錄因子-靶基因相互作用。比較分析揭示了雜交種中網絡的顯著擴展，連接基因相對于雌性和雄性親本分別增加了1.52倍和1.49倍。網絡復雜性同樣增加，基因對比任一親本多1.92倍和1.81倍。值得注意的是，39.2%的雜交種GRN連接代表了雙親中都不存在的新相互作用。并且雜交種GRN中有線連接的基因對中，只有2.88%是從其親本遺傳而來。這些發現表明，雜交誘導了深刻的轉錄組重連，暗示網絡層面的機制可能補充遺傳模型來解釋雜種優勢。

自20世紀60年代單交雜交種發展以來，美國和中國的玉米產量分別增加了4.5倍和2.7倍，這兩個國家是世界上最大的玉米生產國。了解育種改良的分子基礎對于提高育種效率非常重要。先前的研究調查了玉米馴化和改良過程中的遺傳和基因組變化。目前的證據表明，馴化瓶頸增加了有害等位基因頻率，而現代育種逐步減少了這種遺傳負荷。此外，優良等位基因的積累有助于表型變異。我們對具有歷史意義的中國雜交種的分析揭示了現代育種過程中有害等位基因數量的持續下降。值得注意的是，互補的有害等位基因比例與雜交種的釋放年份和籽粒產量呈正相關。這些發現表明，有害等位基因的互補一直受到選擇，并為現代雜交玉米育種做出了貢獻。

調控遺傳變異在作物馴化和適應中發揮了關鍵作用，玉米中已克隆QTLs的64%自然變異可歸因于調控變化。比較轉錄組分析揭示了玉米馴化和改良過程中共表達網絡的重組。值得注意的是，負責這些轉錄組變化的關鍵調控基因在脅迫響應通路中功能富集。此外，雜交種及其親本的基因表達變異已在不同植物中得到表征。盡管玉米雜交種的許多性狀表現出優異的性能，但在不同組織和不同雜交種中，大多數基因表達模式是加性的。本研究一個有趣的發現是，與親本相比，光合作用相關基因在雜交種中偏向于過顯性表達，而與脅迫響應相關的基因則下調。我們觀察到的光合作用相關基因和脅迫響應基因之間的表達權衡表明，基因網絡存在潛在的重編程，使雜交種能夠在不同條件下生長更快、積累更多生物量并產生更高產量。一致地，先前的研究表明，擬南芥雜交種中增強的光合作用與營養生長活力相關。此外，擬南芥雜交種表現出光合作用功能內中樞調控基因的高親顯性表達互補。脅迫相關基因在正常條件下表達受到抑制，但在脅迫條件下在雜交種中被誘導至中親或更高水平。理解玉米中脅迫響應與生長調控通路之間的調控相互作用，將有助于設計在不利環境條件下仍能保持高生產力的抗逆作物品種。

等位基因特異性表達（ASE）代表了雜交種中的重要調控機制。Guo等人首次報道了植物雜交種中的ASE模式，證明了玉米雜交種中親本等位基因對非生物脅迫響應的差異表達。通過全基因組ASE分析，我們發現等位基因對種植密度脅迫的特異性響應在玉米雜交種中普遍存在。基因編碼序列中的大效應變異，例如蛋白質截斷變異，經常導致功能喪失等位基因，并可能表現出被抑制的等位基因表達。我們的研究結果顯示，有害等位基因抑制的比例與育種改良期間雜交種產量增加呈顯著正相關，支持了順式調控選擇在雜交育種中的主要作用。值得注意的是，順式調控區域中有害變異的互補比編碼變異顯示出更強的選擇特征和產量相關性，這與先前觀察到的玉米馴化和改良過程中順式調控區域選擇特征一致。

自達爾文首次記錄雜種優勢以來，這一現象的遺傳基礎一直是一個持續爭論的主題。雜種優勢的遺傳基礎主要通過兩個經典模型來解釋：顯性假說和超顯性假說。雖然單一位點超顯性可以在特定情況下驅動雜種優勢，但全基因組研究表明，顯性效應在大型雜交群體中與產量或其他性狀相關的位點普遍存在。然而，這些遺傳模型仍然不完整，促使了像基因平衡假說和蛋白質質量控制假說這樣的替代框架來彌補其局限性。我們的研究引入熵作為雜種優勢的新指標，量化雜交種在不同發育階段和脅迫條件下的轉錄組可塑性。熵減少與雜種優勢之間的顯著相關性，與薛定諤“負熵”作為生物組織原則的概念相一致。雜交種中較低的轉錄組熵，意味著從均勻的表達分布向更具結構性的分布轉變，可能反映了一個更“協調”的轉錄程序。這種增加的協調性可能通過減少轉錄噪音和集中表達于關鍵通路來提高資源分配的效率，從而通過提供更大的表型穩定性和適應性來促進雜種優勢。這種轉錄熵減少機制反映了在其他生物系統中觀察到的現象。盡管建立了降低的轉錄組熵與雜種優勢之間的聯系，未來的研究仍存在關鍵問題——特別是關于雜交種中轉錄組熵減少的潛在機制以及關鍵調控基因在這一過程中的潛在作用。

總之，本研究提供了中國雜交玉米發展史上標志性雜交種及其親本自交系的轉錄組概覽。我們展示了玉米發育和種植密度適應過程中基因和等位基因表達調控的動態。我們的發現推進了對玉米雜交育種改良和雜種優勢的分子理解，并建立了一個新的分子育種框架，該框架利用關鍵等位基因的表達優化來增強雜交種性能。