《Plant Biotechnology Journal》：The Rice Cis-Natural Antisense Transcript NAT1850 of Pri-miR1850 Negatively Regulates Cold Tolerance by Repressing NPR3
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本研究聚焦水稻反義天然轉錄本（cis-NATs）的功能，發現NAT1850通過形成雙鏈RNA與pri-miR1850相互作用，產生小干擾RNA siR1850，共同負向調控低溫耐受性。關鍵機制在于siR1850與miR1850.1均靶向并抑制NPR3基因，而NPR3作為轉錄共激活因子與WRKY76協同激活DREB1B以響應冷脅迫。有趣的是，NAT1850-siR1850模塊還通過獨立于miR1850.1-NPR3的通路調控氮同化和產量，揭示了pri-miRNA與其cis-NAT在平衡抗逆與生長中的新調控模式。
1. 引言
非編碼RNA（ncRNAs）在植物發育、免疫和脅迫響應中扮演重要角色，其中反義天然轉錄本（NATs）廣泛存在于植物基因組，但功能大多未知。本研究旨在解析水稻中一個與冷響應miRNA（miR1850）位點完全重疊的cis-NAT（NAT1850）的調控功能及其在冷脅迫下的作用機制。
2. 結果
2.1 NAT1850是水稻Pri-miR1850的反義天然轉錄本
基于數據庫分析和RACE測序，研究者鑒定到一個與水稻特有初級miRNA pri-miR1850完全序列重疊的轉錄本Os05g0528701，并將其命名為NAT1850。該轉錄本不編碼蛋白質，被證實為cis-天然反義長鏈非編碼RNA（cis-lncNAT）。表達分析顯示，pri-miR1850的轉錄水平高于NAT1850，但兩者在幼苗不同發育階段和不同組織器官中的表達模式相似，均在根部和開花后5天的種子中表達較高。
2.2 Pri-miR1850與NAT1850之間的相互調控
研究發現，pri-miR1850能促進NAT1850的積累，而成熟的miR1850.1和miR1850.2則不能。雙熒光素酶報告實驗證實，pri-miR1850能增強NAT1850啟動子活性。另一方面，過表達NAT1850會降低pri-miR1850轉錄本及其成熟產物miR1850.1和miR1850.2的水平。瞬時共表達實驗表明，NAT1850直接抑制pri-miR1850，但并不作為內源性靶標模擬物（target mimic）來抑制成熟的miR1850s。
2.3 源于Pri-miR1850轉錄本的21 nt siRNA（siR1850）的形成
pri-miR1850和NAT1850在細胞質中可形成雙鏈RNA（dsRNA）。小RNA測序（sRNA-seq）發現了一個在該區域上調的21 nt小RNA，命名為siR1850。siR1850序列來自pri-miR1850鏈，其中17個核苷酸與miR1850.1重疊，4個與miR1850.2重疊。研究表明，siR1850的產生依賴于DCL1和RDR6，證實其是由pri-miR1850-NAT1850 dsRNA經RDR依賴性途徑產生的siRNA。在過表達pri-miR1850和NAT1850的株系中，siR1850積累增加。
2.4 NAT1850和siR1850負向調控水稻低溫耐受性
與miR1850.1類似，NAT1850和siR1850的表達在冷脅迫下被抑制。表型分析表明，過表達NAT1850或人工siR1850（asiR1850）的轉基因株系，在幼苗期和孕穗期均表現出比野生型更差的耐冷性。具體表現為幼苗存活率降低、葉片萎蔫更嚴重、活性氧積累更高，以及孕穗期冷處理后花粉育性和結實率顯著下降。
2.5 siR1850靶向并抑制NPR3
生物信息學預測和RNA-seq分析發現，siR1850和miR1850.1共同靶向NPR3基因。NPR3的3‘ UTR區域存在兩個siR1850的靶位點，它們部分與miR1850.1的靶位點重疊。5’ RACE實驗證實siR1850能切割NPR3 mRNA。在過表達NAT1850或asiR1850的株系中，NPR3的轉錄水平下調，且其冷誘導程度減弱。雙熒光素酶報告實驗進一步驗證了siR1850對NPR3的靶向作用。
2.6 NPR3作為WRKY76的共調節因子在冷脅迫下激活DREB1B
通過酵母雙雜交、免疫共沉淀、雙分子熒光互補和熒光素酶互補成像等多種技術，證實NPR3與轉錄因子WRKY76存在蛋白互作。雙熒光素酶報告實驗表明，NPR3本身不具有轉錄激活活性，但能作為WRKY76的共激活因子，顯著增強WRKY76對下游冷響應基因DREB1B啟動子的激活能力。在過表達NPR3的株系中，WRKY76和DREB1B的表達上調；而在NPR3敲除突變體中，它們的表達下調。
2.7 NAT1850-siR1850模塊以NPR3依賴性方式調控冷脅迫響應
遺傳學證據表明，NAT1850和siR1850作用于NPR3的上游。在NPR3功能缺失突變體（NPR3-KO）背景下，過表達NAT1850或asiR1850并不能使植株的耐冷性進一步惡化。同時，在NPR3-KO背景下，過表達NAT1850或asiR1850也無法改變下游基因WRKY76和DREB1B，以及孕穗期耐冷相關基因CTB3、MAPK3和TPP1的表達水平。這些結果證明，NAT1850-siR1850模塊通過NPR3依賴的信號通路調控水稻的低溫耐受性。
2.8 NAT1850和siR1850通過獨立于miR1850.1-NPR3的途徑調控水稻產量
有趣的是，NAT1850-siR1850模塊在調控產量方面與miR1850.1-NPR3通路分離。過表達NAT1850或asiR1850導致植株變矮、主穗變短、穗重和每穗粒數減少，但過表達amiR1850.1則不影響產量。轉錄組分析顯示，asiR1850株系中氮代謝相關基因（如NRT2.1、NR1、NR2、NR1.2）顯著下調，而amiR1850.1株系中則無此變化。相應地，NAT1850和asiR1850株系的硝酸還原酶（NR）活性、銨根離子（NH4+）和谷氨酰胺（Gln）含量均降低。這表明NAT1850和siR1850通過一個獨立于miR1850.1-NPR3的途徑調控氮同化和水稻產量。
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3. 討論
本研究揭示了一種pri-miRNA與其cis-NAT的新型調控模式。pri-miR1850促進其反義鏈轉錄本NAT1850的積累，而NAT1850則通過與pri-miR1850形成dsRNA，一方面抑制成熟miR1850s的產生，另一方面經RDR6/DCL1依賴途徑產生siR1850。siR1850與miR1850.1功能匯聚，共同靶向抑制NPR3。NPR3作為WRKY76的轉錄共激活因子，觸發DREB1B表達以增強耐冷性。在正常條件下，該模塊抑制NPR3表達，避免其高表達導致的生長抑制（生長-防御權衡）；在冷脅迫下，模塊表達被抑制，解除對NPR3的抑制，使其快速積累以激活抗冷通路。此外，NAT1850-siR1850模塊還通過另一獨立通路調控氮同化相關基因，影響水稻產量。該研究為理解非編碼RNA互作網絡在植物平衡抗逆與生長中的復雜作用提供了新視角。
