炎癥是生物體對抗不利環境因素的適應性反應，旨在恢復組織和器官功能。除了由機械化學損傷、微生物感染以及細胞代謝產生的高水平自由基誘導氧化應激引發的原發性炎癥外，也可能發生慢性炎癥過程（圖1）。這種狀態是基礎穩態和慢性炎癥之間過渡的原因，通常由長期暴露于內源性或代謝應激條件（如衰老、肥胖或細胞碎片等）所觸發。副炎癥綜合征用于在應激下維持組織功能，指的是基礎穩態和慢性炎癥之間出現的低級別、適應性免疫反應，是對持續性內源性應激源的反應。持續激活可導致慢性病理結果，這由多種易位因子（包括核因子κβ (NF-κβ)、誘導型一氧化氮合酶 (iNOS) 或環氧合酶-2 (COX-2) 等）的激活所控制。這些分子通過改變白介素環境刺激免疫細胞的募集和自身反應性，從而延續這些病理生理狀況。

在影響炎癥進程的環境因素中，飲食提供的生物分子可能潛在地與免疫細胞受體相互作用，或阻止促炎介質的轉錄。除了營養素，植物性食物中的其他生物活性化合物（稱為植物化學物質）可以抵御炎癥。在這方面，西蘭花（Brassica oleracea var. italica）因其營養和植物化學物質的豐富性而受到認可。西蘭花中描述的生物活性化合物已被證明是有效的炎癥調節劑，支持了調整飲食模式的理性醫學建議。然而，盡管有證據，西蘭花植物化學物質在預防氧化應激和炎癥之間循環過渡方面的效率需要進一步證明（圖1）。

考慮到西蘭花中存在的植物化學化合物，特別是對炎癥有活性的，硫代葡萄糖酸鹽（GSL）由一個β-d-硫代葡萄糖與一個磺化肟部分和一個源自前體氨基酸的可變側鏈（R）構成。GSL的生物活性源于它們通過β-硫代葡萄糖苷酶催化的水解酶促轉化為生物活性衍生物（例如異硫氰酸酯 (ITCs)）。在ITCs中，蘿卜硫素（SFN）在與炎癥介質反應性方面是研究最深入的。因此，其解決與這一過程相關的分子級聯反應的能力已得到廣泛證明。因此，基于西蘭花的材料已被建議作為抗炎功能成分，為副產物的增值提供了機會。因此，在評估酶水解之外這些材料的當前替代方案時，應注意胃腸道消化過程中生物活性ITC的釋放取決于特定的物理化學環境和酶活性。因此，從功能上探索ITCs的生物可利用性（即胃腸道消化過程中從食物基質釋放并可用于吸收的生物活性化合物比例）對抵抗副炎癥的作用，可以為加強這些材料的可持續增值替代方案提供證據。

基于這些背景，本研究旨在闡明西蘭花莖稈中生物可利用的ITCs（以SFN為代表）如何有助于降低副炎癥綜合征介質（COX-2，以及與氧化應激相關的類二十烷酸 (8-iso-PGF_2α) 和炎癥相關的類二十烷酸 (PGF_2α和 PGE₂)）的產生。通過評估SFN劑量依賴性地調節COX-2水平和相關類二十烷酸的能力，在模型系統中進一步證實了其預防副炎癥的能力，從而突出了其調節關鍵促炎脂質介質的潛力。

通過體外模型評估了穩定化西蘭花莖稈材料預防腸道上皮副炎癥綜合征的能力。根據文獻描述，西蘭花莖稈經過最小化加工和最佳脫水條件預處理，以最大化胃腸道消化后腸道管腔中生物可利用的ITC和吲哚濃度。應用這種加工條件得到的西蘭花材料中，硫代葡萄糖酸鹽（包括glucoiberin (GI)、glucoraphanin (GR)、hydroxy-glucobrassicin (HGB)、glucoerucin (GE)、glucobrassicin (GB)、gluconasturtiin (PE)、methoxy-glucobrassicin (MGB) 和 neo-glucobrassicin (NGB)）的濃度遞減順序為：GR (2423.2 mg/kg dw) > GI 和 MGB (平均458.9 mg/kg dw) > GE (235.8 mg/kg dw) > GB、HGB 和 NGB (平均106.1 mg/kg dw)。正如預期，最成熟的ITC（SFN）的前體GR最為豐富，解釋了生物可利用的GSL衍生物中SFN占主導地位的情況。同樣，記錄的GE高濃度也至關重要，因為該GSL被水解為erucin，然后進一步轉化為SFN，從而大大促進了西蘭花莖稈材料的抗炎能力。

為了確認SFN在生物可利用部分的主導地位，從而確定西蘭花莖稈粉在口服攝入后預防氧化條件下繼發性副炎癥的實際能力，將獲得的材料暴露于靜態體外模擬胃腸道消化，該模擬模擬消化生理（機械、熱、化學和酶）條件。生物可利用部分的定量分析證實，植物材料中的GSL水平在胃腸道消化期間降至檢測限以下。這些發現與先前關于此類硫化合物在胃腸道消化期間對物理化學環境的穩定性的描述一致，允許ITCs和吲哚釋放到腸道管腔中。或者，在監測的一系列ITCs和吲哚（SFN、erucin、iberin、indole-3-carbinol和3,4-diindolylmethane）中，平均而言，消化過程產生了4.32 mg/kg dw（生物可利用部分為0.072 μg/mL）的SFN，這是消化后可定量水平的唯一GSL衍生品。這一結果與西蘭花莖稈中SFN前體（GR和GE，可氧化為SFN，尤其在酸性條件下）的主導地位相符，這些前體在胃腸道消化過程中通過轉化途徑GR > SFN和GE > E > SFN產生SFN。考慮到植物材料中GR、GE和SFN的濃度，生物可利用部分中SFN的量似乎有限。然而，消化過程中的物理化學條件和酶活性不僅將GSL轉化為ITC和腈衍生物，還降解新形成的化合物。這一事實進一步支持了SFN在消化過程中對酶降解的穩定性，其回收率在37%至64%之間，遠高于其他ITCs或吲哚報告的值。

由于SFN具有生物活性，其在腸道管腔中的濃度可用于細胞攝取，從而可能有助于前沿性地預防與炎癥相關疾病相關的分子通路�；�于此證據，SFN已被證明的抗炎能力為腸道上皮提供了寶貴的保護，從而減弱了相關的自身反應性免疫反應。然而，據我們所知，SFN在生物可利用濃度下的生物活性仍未得到證實。為此，本研究評估了西蘭花莖稈胃腸道消化后提供的生物可利用SFN部分預防氧化應激觸發的副炎癥的能力。為此，評估了西蘭花莖稈消化產物降低COX-2表達的能力。這是一種可誘導的環氧合酶亞型，在炎癥和氧化刺激下產生，催化生物活性脂質的合成，即前列腺素類 (PGF_2α和 PGE_2α) 和異前列腺素 (8-iso-PGF_2α)。為了進一步證明SFN的抗炎能力，超越生物可利用部分中不可避免地存在的額外植物化學物質的貢獻，使用了模型系統來確認單獨SFN在從西蘭花莖稈生物可利用部分記錄的濃度開始的遞減濃度范圍內的能力。

為了闡明生物可利用的SFN阻斷副炎癥相關的生物活性脂質合成所代表的分子機制的能力，監測了負責催化類二十烷酸合成第一步的COX-2酶表達的變化。作為補充，還測定了被認為是氧化應激（8-iso-PGF_2α）和炎癥（PGF_2α和PGE₂）標志物的生物活性脂質水平。PGE₂和PGF_2α是與炎癥病理生理學和免疫系統調節密切相關的典型COX-2衍生介質，而8-iso-PGF_2α是一種非酶促F₂-異前列腺素，被廣泛認為是人類和實驗模型中脂質過氧化和氧化應激的金標準標志物。這些類二十烷酸共同提供了生物可利用SFN靶向的副炎癥反應組成部分的綜合結果。

帶著這個目標，基于飲食或保健品攝入的生物活性化合物的生物可利用部分活性，選擇腸道上皮（Caco-2細胞）的氧化應激體外模型進行這些測定。

體外纖毛狀腸道上皮單層暴露于促氧化刺激（50 μM H₂O₂）以誘導副炎癥表型和相關信號通路，其中央事件是COX-2表達的上調。在促氧化條件下監測COX-2水平1小時，這提供了最高的酶表達。

在缺乏生物活性化合物（陽性對照）的情況下暴露于促氧化環境的腸道上皮細胞顯著增加了COX-2水平（平均高達147.56 ng/mL，幾乎是未用H₂O₂處理的基線細胞記錄濃度的2.5倍 - 56.86 ng/mL）（?1) recorded at 1 hour after the application of the oxidative stimulus in the absence and presence of digestion products (bioaccessible SFN (diluted 1?:?10 (v/v) to achieve the final concentration of 0.007 μg mL^?1in the wells) from broccoli stalks). Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">圖2）。

或者，當上皮細胞用含有0.072 μg/mL SFN的西蘭花莖稈生物可利用部分預處理（稀釋1:10，v/v，以達到孔中最終濃度0.007 μg/mL）時，COX-2表達的增加被阻止，平均值為92.07 ng/mL，顯著低于陽性對照（圖2中的黑色虛線）。

這些結果表明，生物可利用的SFN可以下調由促氧化條件（50 μM H₂O₂）誘導的COX-2表達。值得注意的是，這種效應反映了對COX-2表達的調節，而不是直接抑制COX-2的酶活性。因此，SFN不是COX-2活性位點的經典抑制劑；相反，其抗炎活性主要通過上游調節機制介導，包括抑制NF-κB和MAPK信號通路以及激活Nrf2/HO-1通路，這些共同調節COX-2基因轉錄。因此，相對較低的濃度可能通過轉錄水平的信號放大機制引發顯著的生物學效應，而無需與酶的催化位點直接相互作用。然而，盡管生物可利用的SFN與西蘭花莖稈抗炎能力之間存在顯著相關性，但西蘭花莖稈粉的胃腸道消化可能產生額外的生物活性化合物，即使濃度低于定量限（微量，例如5-咖啡酰奎尼酸和對香豆�？�尼酸）。

這些額外的生物活性分子可能有助于抑制COX-2表達，從而增強西蘭花莖稈生物活性成分的抗炎潛力，或者它們可能拮抗SFN的生物活性，從而限制其實際的抗炎能力。為了克服這一限制并進一步證實生物可利用SFN降低COX-2表達的潛力，開發并評估了一個模型系統，該系統由SFN溶液組成，其濃度范圍從幾乎記錄的生物可利用部分濃度開始遞減（0.100、0.050、0.025、0.013和0.007 μg SFN/mL）（?1 in the well) recorded at 1 h after oxidative stimulus (50 μM H₂O₂) in the absence and presence of digestion products, and in a model system using dilutions (0.0100, 0.0050, 0.0025, 0.0013, and 0.0007 μg mL^?1, final concentrations in the well) of the authentic SFN standard. Positive control (black dotted line): COX-2 expression in intestinal epithelial cells exposed to prooxidant conditions in the absence of bioactive compounds. Negative control (red dotted line): COX-2 expression in intestinal epithelial cells under basal (non-prooxidant) conditions. Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">圖3）。

當評估不含額外生物活性化合物的遞減SFN濃度（在培養基中稀釋1:10，以達到孔中最終濃度0.0100、0.0050、0.0025、0.0013和0.0007 μg SFN/mL）的能力時，發現它們都以相當（無顯著差異）的水平降低了COX-2的表達（相對于在促氧化條件下維持的細胞降低了53.6%），這與生物可利用SFN發揮的抑制能力不同，后者將在氧化環境中記錄的細胞COX-2表達減弱了37.6%（圖3）。

這一結果強化了先前關于SFN通過食用西蘭花莖稈產品預防副炎癥綜合征關鍵作用的證據，這些產品提供了能夠下調COX-2表達的生物活性生物可利用部分。有趣的是，除了與生物可利用部分記錄的濃度匹配的分離SFN的抑制能力外，抑制效率一直保持到測試的最低濃度（0.0007 μg SFN/mL），該濃度顯著降低了促氧化環境誘導的COX-2表達；然而，這并未恢復到基線水平（陰性對照，由暴露于不含SFN和H₂O₂的消化空白補充培養基的Caco-2細胞組成，從而提供基礎COX-2表達水平）（圖3中的紅色虛線），表明抑制效應與SFN暴露具體相關。這一結果不排除西蘭花莖稈中額外的生物可利用分子可能發揮互補生物活性的貢獻，從而增強整體抗炎效果。事實上，迄今為止，在鑒定具有生物活性潛力的分子以實現調節抗炎反應的功能相互作用（協同或拮抗）方面，特別是在具有不同化學特征的化合物中，仍存在知識空白。

關于SFN抑制COX-2依賴性炎癥的機制，該化合物抑制NF-κB和MAPK通路。這些機制減少了額外的炎癥介質（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8）。為了表征生物可利用SFN對副炎癥的影響，我們專門針對COX-2類二十烷酸軸（PGE₂、PGF_2α、8-iso-PGF_2α），因為這些是這一級聯反應的既定功能標志物。因此，雖然監測額外的蛋白質水平標志物如丙二醛、谷胱甘肽或凋亡終點將提供互補分析，但我們有針對性的組合提供了生物可利用SFN調節的COX-2依賴性副炎癥的直接證據。

觀察到的生物可利用SFN對COX-2和類二十烷酸產生的抑制作用與其已建立的機制一致，涉及NF-κB和MAPK通路抑制以及Nrf2/Keap1抗氧化通路的強效激活，誘導HO-1。盡管對這些上游調節因子的直接評估超出了我們的實驗范圍（特別針對副炎癥模型中的功能性COX-2類二十烷酸軸），但這些機制可能有助于SFN使用生物可利用的西蘭花莖稈來源SFN觀察到的異前列腺素和前列腺素類調節。

為了探究生物可利用SFN調節異前列腺素類（特別是被視為監測氧化應激金標準的8-iso-PGF_2α）產生的能力，將腸道上皮暴露于促氧化環境（50 μM H₂O₂）。該處理使8-iso-PGF_2α濃度從未刺激對照的平均3.6 ng/mL增加到平均9.8 ng/mL（1.7倍增加）在1小時后（?1) (8-iso-PGF_2α, PGF_2α, and PGE₂) by bioaccessible SFN (diluted (v/v) 1?:?10 in culture media to achieve the final concentration of 0.007 μg mL^?1in the well) at 1 hour post-oxidative stimulus (50 μM H₂O₂). Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">圖4）。

或者，用含有0.072 μg SFN/mL（稀釋1:10，v/v，以達到孔中最終濃度0.007 μg/mL）的西蘭花莖稈生物可利用部分預處理細胞，減輕了異前列腺素的增加，導致8-iso-PGF_2α濃度相對于陽性對照（黑色虛線）降低了23.5%（圖4）。

由氧化狀態引起的繼發性炎癥反應通過測量前列腺素類PGF_2α和PGE₂的水平來監測。這些評估表明，當暴露于氧化條件1小時時（陽性對照，黑色虛線），Caco-2細胞產生高達129.8 ng/mL的PGF_2α（平均比未處理細胞高37.8%）。這些生長條件也使PGE₂濃度增加了67.2%（從1.7到4.1 ng/mL）（圖4）。

與我們的初始假設一致，用生物可利用SFN預處理Caco-2細胞阻止了PGF_2α和PGE₂水平的增加，與陽性對照（黑色虛線）相比，濃度分別降低了23.0%和42.0%，盡管這些處理未達到基礎條件（陰性對照，紅色虛線）（圖4）。

當分析生物可利用SFN調節COX-2表達的能力時，使用模型系統進一步證實了其抑制前列腺素類（氧化應激和炎癥的標志物和介質）分泌的潛力（?1) of the isoprostane 8-iso-PGF_2αand the prostaglandins PGF_2αand PGE₂by bioaccessible SFN (0.007 μg mL^?1, final concentration in the well) recorded at 1 h after oxidative stimulus (50 μM H₂O₂) in the absence and presence of digestion products, and in a model system using dilutions (0.0100, 0.0050, 0.0025, 0.0013, and 0.0007 μg mL^?1, final concentrations in the well) of the authentic SFN standard. Positive control (black dotted line): prostanoid concentrations in wells with intestinal epithelial cells exposed to prooxidant conditions in the absence of bioactive compounds. Negative control (red dotted line): prostanoid concentrations in wells with intestinal epithelial cells under basal (non-prooxidant) conditions. Distinct lowercase letters indicate values significantly different at p < 0.001 according to one-way analyses of variance (ANOVA) and Tukey's multiple range test (n = 3).">圖5）。這種方法揭示了分離的SFN（不含額外植物化學物質）調節8-iso-PGF_2α、PGF_2α和PGE₂分泌的能力。

對于8-iso-PGF_2α，觀察到了某種波動的模式。雖然生物可利用SFN顯示出降低該氧化應激標志物的趨勢（與陽性對照相比平均降低了29.4%），但并非所有濃度下的降低都顯著（圖5）。有限的能力與SFN的結構限制相符，這賦予了該ITC間接抗氧化特性。這種類型的抗氧化化合物激活Keap1/Nrf2/ARE通路，從而誘導催化直接抗氧化劑合成的細胞保護酶的表達。因此，SFN的間接抗氧化功能是延遲的，這可能無法實現，這與其通過異前列腺素上調控制細胞對氧化應激反應的能力有限相一致。相比之下，SFN調節炎癥介質的公認能力通過降低幾乎所有測試濃度下的PGF_2α和PGE₂濃度得到證明。有趣的是，盡管兩種前列腺素類都減少了，但它們的具體反應不同。

在模型系統上，真實SFN標準的遞減濃度逐漸降低了PGF_2α的分泌，從生物可利用SFN（0.007 μg/mL）達到的水平降至74.8 ng/mL，分別對應于PGF_2α降低22.9%和42.4%（圖5）�；蛘�，模擬中達到的PGE₂水平在幾乎所有測試的SFN濃度范圍（除了0.0007 μg SFN/mL）都顯著更高（圖5）。

這一結果表明，生物可利用SFN通過調節特定介質表現出強大的抗炎能力，且不依賴于過程的起源（直接炎癥或副炎癥）。然而，這種生物效力可能在某種程度上取決于培養基中是否存在額外的生物活性化合物，這些化合物將微調單個有機硫化合物的抗炎能力。事實上，這些加性或協同效應可能歸因于，例如，西蘭花莖稈生物可利用部分中也描述的咖啡�？�尼酸和對香豆酰奎尼酸，它們的抗炎能力也已得到證實。

根據本研究描述的主要結果，SFN通過COX-2調節前列腺素分泌的能力可以影響副炎癥綜合征的發生和進展，特別是考慮到報告的炎癥性前列腺素譜與白細胞介素水平之間的密切聯系。

從本研究中獲得的結果進一步支持了西蘭花莖稈（一種未充分利用的副產品）作為SFN來源的潛力，描述了其生物可利用性（消化釋放和穩定性）。由于在消化過程中的物理化學條件和酶活性下的不穩定性，從植物材料的GSL譜預期的多種ITCs和吲哚未以可定量濃度存在于生物可利用部分。盡管一系列ITCs和吲哚發生降解，但評估預防氧化應激繼發性副炎癥綜合征的能力時，發現生物可利用SFN可以預防副炎癥。使用模擬其在腸道管腔中濃度的模型系統評估生物可利用SFN的生物活性表明，這種具有推定生物活性的有機硫化合物是主要抗炎活性的原因，并且在較小程度上是預防氧化應激的原因。總之，這些結果表明，將西蘭花莖稈粉與從農業食品副產品或可食用材料來源獲得的其他成分（具有顯著的抗氧化潛力）相結合，可以應對與氧化應激繼發性副炎癥綜合征相關的所有生物學途徑。