圖像激活細胞分選（IACS）能夠基于細胞的實時圖像分析進行高速分選，為在單細胞水平上大規(guī)模關聯細胞形態(tài)與功能提供了強大工具。盡管IACS已成功應用于多種中小型細胞，但將其應用于大細胞（>20 μm直徑）、細胞簇和其他大型物體仍然面臨挑戰(zhàn)，而這在科學和工業(yè)領域具有重要價值。主要困難在于如何在微流控芯片內，從入口到出口（尤其是圖像采集和分選區(qū)域）全程控制大而復雜的細胞。傳統的基于水動力聚焦的IACS系統難以在圖像處理所需的時間間隔內維持大物體的穩(wěn)定聚焦，導致分選純度、回收率或事件率降低。為了克服這些限制，本研究報道了一種基于彈慣性聚焦的IACS系統，該系統能夠在~1 m s^?1的高流速下實現大細胞的IACS。

本研究開發(fā)的彈慣性聚焦基IACS系統示意圖展示了其用于大細胞圖像激活分選的工作原理。該系統基于先前報道的智能IACS，無縫集成了幾個關鍵組件：一個用于在長微通道中心維持大物體聚焦的彈慣性聚焦器；一個基于虛擬凍結熒光成像的光機械顯微鏡，用于以0.361 μm/像素的分辨率高速獲取無模糊的雙通道熒光圖像；一個用于測量細胞流速的速度計；一個用于實時處理細胞圖像并做出分選決策的智能圖像處理器；以及用于在細胞流經芯片時快速分離目標細胞的片上雙膜推拉泵。引入的彈慣性聚焦器是一個長66 mm、橫截面為正方形（邊長120 μm）的直微通道。聚焦器由環(huán)烯烴聚合物（COP）制成。聚焦器將細胞流維持在微通道中心，細胞在距入口31-32 mm處被光機械顯微鏡成像，圖像由智能圖像處理器分析。利用速度計預測的分選時機，目標細胞由雙膜泵分選。本研究使用0.1%（w/v）透明質酸鈉（HA）溶液作為聚焦介質。

使用不同尺寸的聚苯乙烯（PS）顆粒評估彈慣性聚焦器的性能。將直徑為10.3 μm、14.5 μm和24.5 μm的PS顆粒懸浮液注入聚焦器，流速為420 μL min^?1（對應于通道中心最大流速~1 m s^?1）。通過高速相機記錄顆粒在不同入口距離（L）處的流動，并測量每個顆粒相對于微通道中心的垂直距離（d）。隨著L增加，所有尺寸的顆粒都顯示出逐漸變窄的單峰分布，中心在-2 μm < d < 2 μm范圍內，表明在彈慣性聚焦器中實現了有效聚焦。更定量的分析顯示，24.5 μm和14.5 μm顆粒的d標準差（SD）隨L增加而減小，在L > 30 mm時分別達到<2 μm和<8 μm。這個L范圍覆蓋了從成像區(qū)域（L = 31-32 mm）到分選區(qū)域上游邊緣（L = 66 mm）的整個距離。雖然10.3 μm顆粒的SD也隨L逐漸減小，但總體聚焦效果不如大顆粒，僅在L > 45 mm時SD < 12 μm。這些結果表明，我們的聚焦器能夠可靠地維持直徑至少14.5 μm的物體（包括直徑達24.5 μm的顆粒）在1 m s^?1流速下聚焦36 ms，超過了先前IACS演示的物體尺寸。

為了驗證彈慣性聚焦對生物細胞的適用性，接下來讓纖細裸藻（Euglena gracilis）細胞以相同流速流經聚焦器，并將其聚焦性能與14.5 μm顆粒（其直徑與細胞寬度相當）進行比較。細胞的位移d分布隨L增加顯示出逐漸變窄的峰值，但其d的SD在L > 30 mm時穩(wěn)定在約10 μm，是顆粒觀察值的兩倍多。細胞聚焦性能的降低主要歸因于細胞形態(tài)更大的變異性。細胞聚焦性能與細胞面積、縱橫比、短軸和長軸的進一步分析表明，較大的縱橫比較短的短軸與聚焦性能受損相關。

為了驗證彈慣性聚焦基IACS系統，我們進行了熒光PS顆粒的圖像激活分選。制備了24.5 μm和14.5 μm PS顆粒的1：1混合物，其中24.5 μm顆粒被指定為分選目標。在分選前，每個顆粒群體被IACS系統單獨成像。使用3635張目標和6863張非目標的IACS圖像預訓練了一個LeNet-5-dropout卷積神經網絡（CNN）模型。訓練和驗證準確率在20個訓練周期后接近100%。該模型在保留數據上測試時達到了99.88%的精確度和99.89%的召回率。然后將該模型應用于顆粒混合物IACS期間的實時分類。在172 eps的事件率下，96.9%的事件在32 ms內被處理完畢，這是我們的IACS系統中顆粒從成像區(qū)域行進到分選區(qū)之前進行圖像處理和決策所需的實際最小時。在此事件率下，計算得出的純度和回收率分別為96.0%和80.5%。純度在更高的264 eps（92.6%）和312 eps（92.6%）事件率下仍保持較高水平。然而，隨著事件率增加，在32 ms內處理的事件比例下降至61.0%（264 eps）和32.7%（312 eps），導致相應的分選回收率下降至51.9%和23.1%。這些結果突顯了在使用基于深度學習的分類模型的IACS系統中需要更長的處理時間，因此維持大物體的長距離聚焦流動至關重要。

最后，我們基于胞內脂滴含量（一個需要圖像進行細胞分類的形態(tài)學特征）對纖細裸藻細胞（寬度5-20 μm，長度20-50 μm的微藻細胞）進行了IACS，分類由系統的CNN模型判斷。為了準備模型的圖像數據集，我們開發(fā)了一個自定義Python程序，通過閾值化BODIPY 505/515熒光的局部強度最大值來檢測脂滴中心。該程序應用于IACS系統獲取的細胞圖像。檢測到脂滴的細胞被標記為分選目標，而沒有脂滴的細胞則被標記為CNN模型構建的非目標。使用3635張目標圖像和6863張非目標圖像訓練了一個8層CNN。訓練后的模型在第217個訓練周期達到了82.0%的精確度和97.5%的召回率。

然后將這個訓練好的CNN模型應用于纖細裸藻細胞的圖像激活分選。在IACS期間實時獲取的目標和非目標細胞的圖像庫顯示，被分類為目標的細胞在BODIPY熒光通道中表現出更強、更明顯的液滴模式，而被歸類為非目標的細胞在BODIPY通道中顯示很少信號或存在裁剪偽影。在128 eps的事件率下，88.2%的圖像在32 ms內被基于CNN的分類處理完畢。分選后，我們通過應用上述相同的自定義脂滴計數程序來評估CNN模型的決策。結果顯示，73.67%的目標細胞（3638/4938個細胞）被CNN模型正確分類為含有≥1個脂滴，而5.12%的非目標細胞（915/17867個細胞）被誤分類為含有≥1個脂滴。

我們進一步評估了從IACS系統收集的分選后樣品。將從未經分選和經過分選的微流控芯片出口收集的細胞分別通過離心濃縮，轉移到載玻片上，并在商業(yè)熒光顯微鏡下成像。用于CNN模型構建的相同程序應用于這些顯微鏡圖像以計數含有脂滴的細胞。在檢查的160個分選后細胞中，86個細胞（53.8%）含有脂滴，而在270個分選前細胞中只有32個（11.9%）含有脂滴，這對應于我們的彈慣性聚焦基IACS對纖細裸藻細胞實現的4.54倍富集。這些結果表明，我們的系統能夠基于內容豐富且實時的圖像分析實現大細胞的高速分選。值得注意的是，與在相當或更高事件率下的顆粒分選相比，純度較低可歸因于聚焦性能的下降。細胞的聚焦不如14.5 μm顆粒穩(wěn)定。聚焦的波動導致細胞流速的變化，這使得分選驅動的精確同步變得復雜，從而降低了分選準確性。

在本研究中，我們提出并通過實驗證明了彈慣性聚焦基IACS，它能夠在不影響分選純度、回收率或通量的情況下，基于高內涵和實時圖像分析實現大細胞的高速分選。通過將彈慣性聚焦與長微通道相結合，大細胞可以在長距離內被聚焦，從而為基于深度學習的圖像分析提供足夠的計算時間，同時保持高流速。我們首先通過在172 eps事件率下以96.0%純度和80.5%回收率進行大PS顆粒的圖像激活分選，然后通過在128 eps事件率下以73.67%的實時圖像分類準確率和4.54倍富集比進行纖細裸藻細胞的IACS，證明了我們系統的能力。與其他報道的兼容基于深度學習的內容豐富圖像分析的IACS系統相比，我們的系統獨特地演示了迄今為止最大細胞的IACS，同時保持了>100 eps的高事件率。此外，我們的彈慣性聚焦器無需鞘流即可運行，無需復雜的微通道設計或精密的流量控制模塊。

我們的彈慣性聚焦基IACS系統的技術能力可以進一步擴展。首先，可以通過優(yōu)化計算網絡來提高通量。在這項工作中，有限的處理速度導致在定義的32 ms窗口內處理圖像的比例減少，使得回收率在264 eps時降至51.9%，在312 eps時降至23.1%。增強計算機硬件或采用并行計算將提升計算能力，從而允許更高比例的圖像在規(guī)定時間內得到處理。改進微流控通道設計，包括彈慣性聚焦器和雙膜泵井，也可以提高性能。例如，延長聚焦器將為圖像處理提供額外時間。在這項研究中，我們采用了基于COP的片上雙膜推拉泵進行分選驅動。雖然基于COP的微流控芯片成本相對較低，但材料楊氏模量限制了可實現的最大驅動頻率。這一限制可以通過使用更硬的材料（如硼硅玻璃）制造芯片或采用更快的分選機制（如基于聲學的分選或基于微氣泡的分選）來解決。值得注意的是，我們的工作是首次演示將粘彈性流體聚焦與基于壓電驅動器的主動分選（即由微通道外部施加的力激活的分選）相結合。優(yōu)化分選區(qū)域的設計可以進一步提高通量、回收率和純度。我們預計，這些計算和微流控技術的改進也將使得能夠集成能夠處理更高內涵圖像（如多通道、三維（3D）和超分辨率圖像）的分類方法，而不會影響通量。特別地，對于大物體，實施3D圖像至關重要，因為與單平面2D圖像相比，3D圖像能以更高的準確性和可重復性反映完整的形態(tài)學特征。實現大物體穩(wěn)定分選性能的一個潛在限制是顆粒間距。隨著物體尺寸和體積濃度的增加，相鄰物體更有可能發(fā)生耦合振蕩運動，導致流速波動增加，從而降低分選回收率和純度。可能需要進行進一步的調查和應用特定的分選性能優(yōu)化。

在進一步應用方面，我們期望我們的IACS系統可應用于多種大細胞或細胞簇，以實現基于多樣化形態(tài)學特征的IACS。以纖細裸藻為例，我們展示了基于凝聚脂滴存在的IACS，這是先前的高通量微流控分選技術無法利用的特征。這種能力可能有助于全面研究與脂滴凝聚相關的表型-基因型關聯，從而拓寬對纖細裸藻的認識，并支持其在代謝工程和生物燃料生產的菌株工程中的應用。此外，我們的IACS系統可以基于形態(tài)學特征的組合對纖細裸藻細胞進行分選，以富集專門生產特定生化化合物、具有特定光合活性或重金屬去除能力的亞群。除了纖細裸藻，我們預計我們的系統可以擴展到更大生物物體的高通量分選，特別是由患者細胞培養(yǎng)的球體和類器官。盡管它們有望作為可擴展的個體化疾病模型，用于體外評估治療效果，但它們固有的形態(tài)和組成變異導致療效測試的再現性和可靠性較低，這為其臨床應用帶來了挑戰(zhàn)。分離具有特定形態(tài)特征的類器官或球體可以減少藥物反應的變異，從而實現更可靠的個性化預后。雖然本研究開發(fā)的聚焦器仍存在局限性，包括對小的單細胞（直徑<10 μm）聚焦效率低，或與接近或超過微通道邊長（120 μm）的物體不兼容，但這些挑戰(zhàn)可以通過設計優(yōu)化來解決。例如，制造具有更大橫截面的聚焦器將擴展其對更大分選靶標的適用性。我們測試了具有更寬橫截面（邊長150 μm）的聚焦器設計，并確認了對直徑14.5 μm、24.5 μm和51.0 μm顆粒在長距離內的有效彈慣性聚焦。我們預計，由于彈慣性聚焦已在廣泛的流變參數范圍內得到驗證，更大的微通道可以集成到IACS系統中用于分選更大的物體。在活細胞分選應用中，彈慣性聚焦下的細胞活力是一個重要的考慮因素。先前的研究報道了纖細裸藻細胞在流經FACS系統的狹窄微通道后活力降低，表明其對高剪切應力敏感。因此，在為活細胞應用調整聚焦器和分選器設計時，仔細控制應力至關重要。通過這些調整，我們的IACS系統可以適應更多樣化的需求，從而在生物醫(yī)學和環(huán)境應用中實現大細胞或細胞簇形態(tài)特征與細胞功能之間的全面關聯分析。