代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）是全球最普遍的慢性肝病，其病理譜系廣泛，從單純性脂肪變、脂肪性肝炎到纖維化乃至肝硬化。肝纖維化標志著顯著的肝細胞功能障礙的開始，是預測死亡率和肝臟相關事件的主要指標。盡管研究廣泛，但有效的治療策略仍然有限。肝臟硬度已被廣泛接受為MASLD嚴重程度的標準診斷標志物，但其對肝細胞功能的生物學影響尚未得到充分探索。

本研究旨在探究肝臟硬度如何影響肝細胞功能，特別是膽固醇代謝。研究發現，在MASLD患者隊列和小鼠模型中，肝內膽固醇水平與肝臟硬度呈強正相關。進一步的機制研究表明，堅硬的基質通過激活Yes相關蛋白（YAP）和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）來抑制肝臟X受體α（LXRα）的活性。在細胞核內，YAP破壞了LXRα與其異源二聚體伙伴視黃醇X受體α（RXRα）的結合，從而抑制了LXRα的轉錄活性。一致地，肝細胞特異性敲除Yap/Taz促進了小鼠肝臟膽固醇外流，并延緩了膽固醇誘導的纖維化進展。對MASLD患者肝臟的轉錄組學分析證實，LXRα靶基因的表達與肝臟硬度以及YAP/TAZ活性呈強負相關。這些發現揭示了MASLD中肝膽固醇水平的機械敏感性調控，表明肝臟硬度是肝細胞功能障礙的一個因果因素。

MASLD已成為最普遍的慢性疾病，目前影響全球三分之一的人口。盡管研究廣泛，但有效的治療策略仍然有限，Resmetirom和Semaglutide是目前僅獲批準的MASLD療法，且僅帶來適度的抗纖維化益處。

MASLD病理生理學中一個關鍵但尚未充分探索的方面涉及肝臟的機械特性。肝臟硬度已被廣泛接受為MASLD嚴重程度的標準診斷標志物。健康肝組織表現出顯著的柔軟性（1–3 kPa），但進行性纖維化可使硬度增加十倍以上（>20 kPa）。然而，這種機械轉化對肝細胞功能的生物學后果受到的關注有限。

YAP和TAZ是核心機械傳感器，介導細胞對基質硬度、細胞密度、拉伸和壓力負荷等機械線索的反應。在成年肝臟中，YAP/TAZ活性主要局限于膽管細胞，但在患者和實驗性小鼠模型的纖維化肝臟中，肝細胞中YAP/TAZ活性的增強很常見。因此，肝細胞也可能能夠響應基質硬度，特別是在肝纖維化進展期間。

在肝臟中，細胞膽固醇是MASLD進展的關鍵因素。最突出的肝膽固醇調節因子之一是LXRα，一種肝臟富集的核受體。LXRα的缺失或活性受損會導致MASLD中膽固醇蓄積和肝損傷。然而，控制肝膽固醇的有效方法尚未實現，導致MASLD中膽固醇蓄積的內源性線索仍有待闡明。

機械生物學和膽固醇代謝的交集在肝病背景下很大程度上尚未被探索。然而，最近的一項研究表明，膽固醇可作為激活TAZ的上游輸入。這一發現使我們預期，在MASLD中，堅硬基質激活的YAP/TAZ也可能在主動控制細胞內膽固醇水平中發揮作用，這一點尚未被研究。本文假設肝臟硬度通過YAP/TAZ介導的LXRα活性調節直接影響肝細胞膽固醇代謝。

為了研究肝臟力學與膽固醇代謝之間的關系，我們使用瞬時彈性成像技術測量了MASLD患者的肝臟硬度。從整個229名患者的隊列中，34名擁有可用冷凍肝組織的個體根據肝臟硬度被分為3組。我們發現，較硬的肝臟中組織膽固醇水平顯著更高。令人驚訝的是，肝臟僵硬患者的肝臟與血清膽固醇比率是肝臟柔軟患者的三倍多。在所有參與者中，肝臟硬度與肝臟膽固醇水平之間存在穩健的正相關。此外，在獲得的各項臨床參數中，肝臟硬度與肝臟膽固醇水平的相關性最強，超過了組織學纖維化分期。

為了進一步研究肝臟硬化與肝臟膽固醇蓄積之間的聯系，我們檢查了多種飲食誘導的MASLD小鼠模型。一致地，Filipin染色顯示，僅在較硬的肝臟中大量蓄積游離膽固醇。在所有模型中，肝臟硬度與肝臟與血清膽固醇比率呈強正相關。接下來，我們利用一個漸進性小鼠模型，通過給小鼠喂食膽堿缺乏、氨基酸定義的高脂飲食（CDAHFD）0、2、4和12周來代表MASLD的每個階段。正如預期，喂養12周伴隨著肝臟硬度的顯著增加，而在較早時間點觀察到相對較小的變化。與臨床觀察一致，膽固醇蓄積僅在纖維化肝臟中顯著，而在其前階段則不明顯。這與脂滴的形成形成對比，脂滴在脂肪性肝炎發展之前增加，但在纖維化中減少。纖維化肝臟中的肝臟膽固醇含量和肝臟與血清膽固醇比率顯著高于脂肪變或脂肪性肝炎的肝臟，表明從循環中蓄積了更多的膽固醇。小鼠肝臟硬度與肝臟膽固醇的正相關支持了這些結果。

肝臟中膽固醇隨著硬度增加而蓄積的觀察促使我們研究肝細胞中哪些細胞代謝途徑受到機械調節信號的影響。雖然瞬時彈性成像常用于臨床測量組織硬度，但原子力顯微鏡（AFM）用于細胞水平的分辨率。在健康個體中，通過AFM測量的肝臟硬度范圍從柔軟區域的2.0 kPa到富含膠原蛋白區域的10.9 kPa，部分患者局部硬度超過100 kPa。類似地，小鼠肝臟的平均硬度從1.9 kPa（健康）測量到5.1 kPa（纖維化），某些區域高達50 kPa。為了模擬人肝臟的健康和纖維化微環境，肝細胞被培養在軟（1 kPa）或硬（20 kPa）的膠原包被水凝膠上，并進行代謝組學、RNA測序和生化分析。結果，堅硬基質上細胞的細胞內膽汁鹽水平顯著降低。鑒于膽汁鹽是膽固醇代謝的主要產物，這些發現促使我們進一步研究膽固醇相關基因的機械敏感性表達。小鼠原代肝細胞的轉錄組分析顯示，在堅硬表面上，膽固醇代謝相關基因下調，而YAP/TAZ靶基因上調，表明機械轉導增強。具體來說，膽固醇代謝途徑是前7個顯著受影響的途徑之一。基因集富集分析（GSEA）進一步證實了膽固醇穩態和膽汁酸代謝基因的高度富集。確實，我們通過生化定量發現堅硬水凝膠上肝細胞內的膽固醇水平顯著更高。Filipin染色也顯示堅硬水凝膠上肝細胞中膽固醇的機械敏感性蓄積。

接下來，我們進一步分析了參與膽固醇外流、攝取、生物合成和分解代謝的代表性基因的表達。有趣的是，培養在堅硬水凝膠上的原代肝細胞顯示所有這些途徑的基因表達均降低。在蛋白質水平，ABCG8顯著降低，而HMG-CoA還原酶（HMGCR）和CYP7A1基本保持不變。這些發現表明，在堅硬條件下膽固醇生物合成和分解代謝的抑制不是因果機制，而是對細胞內膽固醇蓄積的代償反應。堅硬基質上的肝細胞表現出顯著受損的膽固醇外流以及外源性膽固醇攝取的顯著減少。雖然在堅硬水凝膠上膽固醇外流和攝取均減少，但細胞內膽固醇繼續蓄積，表明外流抑制占主導地位，而攝取減少代表了適應過量細胞內膽固醇的代償性適應。

硬度介導的細胞內膽固醇蓄積出乎意料，因為其他一些細胞類型，如Ras轉化的乳腺上皮細胞（MCF10ATk1）和水生化視網膜細胞（RPE1），反應方向相反。這種差異使我們假設肝細胞擁有一個獨特的機械敏感性調節模塊，控制機械敏感性膽固醇外流。其中，LXRα是一個核受體，它控制將細胞膽固醇輸出到細胞外空間的ATP結合盒轉運蛋白的轉錄以及代謝膽固醇的酶。

為了確認LXRα在肝細胞中的功能相關性，使用siRNA沉默了小鼠原代肝細胞中的LXRα表達。正如預期，敲低LXRα顯著增加了總細胞和游離細胞膽固醇水平。為了進一步評估LXRα的貢獻，來自LXRα敲除小鼠的原代肝細胞被培養在軟或硬的水凝膠上。與野生型細胞不同，LXRα缺陷的肝細胞未能響應堅硬基質而蓄積膽固醇，這與其他非肝細胞系的結果相似。此外，在LXRα缺陷的肝細胞中未觀察到對膽固醇外流關鍵的基因表達變化，這表明LXRα是膽固醇外流機械敏感性調節的關鍵介質。為了研究LXRα活性是否受基質硬度影響，AML12細胞用LXRα的合成配體T0901317處理。在軟水凝膠上，T0901317有效促進了膽固醇從肝細胞中去除，表現為Filipin強度降低。然而，在硬水凝膠上，它未能降低膽固醇水平。在原代肝細胞中用LXRα激動劑處理也發現了類似的結果。此外，去除膽固醇所需的膽固醇外流基因的誘導在堅硬基質上顯著減弱，為這些發現提供了機制解釋。

為了確定肝細胞中的主要機械轉導途徑，從培養在軟或硬水凝膠上的肝細胞的RNA測序數據中比較了GSEA。結果，Hippo信號通路顯示出顯著的富集，而與PIEZO1等其他調節因子相關的鈣介導信號通路僅表現出微小的變化。我們證實原代肝細胞能夠通過培養在堅硬水凝膠上誘導YAP/TAZ的核定位。這些結果表明肝細胞主要通過YAP/TAZ軸感知基質硬度。

為了確定基質硬度是否以YAP/TAZ依賴性方式調節LXRα活性，我們利用AAV8-TBG-Cre病毒在Yap^fl/fl;Taz^fl/fl小鼠的肝細胞中刪除Yap/Taz。注射后十天，通過免疫印跡證實了肝細胞中Yap/Taz的成功刪除。Filipin染色顯示，在Yap/Taz缺失的情況下，膽固醇外流顯著增加。接下來，對野生型和Yap/Taz敲除的原代肝細胞在不同硬度條件下進行了RNA測序。引人注目的是，基因表達的主成分分析顯示，硬度誘導的基因改變在Yap/Taz缺失的情況下顯著減弱，凸顯了肝細胞嚴重依賴Yap/Taz進行機械轉導信號傳導。具體來說，與膽固醇穩態、膽汁代謝和Hippo信號通路相關的機械敏感性基因的轉錄調控也依賴于Yap/Taz的存在。此外，RT-qPCR分析證實，膽固醇輸出蛋白如Abca1和Abcg5的表達在Yap/Taz敲除肝細胞中適度增加。在通過CRISPR-Cas9建立的YAP/TAZ敲除HEK293細胞中，T0901317處理誘導的LXRα靶基因表達顯著敏感化，表明YAP/TAZ具有基礎的抑制作用。

在非再生的成年肝臟中，YAP/TAZ主要受Hippo通路激酶Large tumor suppressor 1和2（LATS1/2）的抑制，有助于維持器官大小。為了評估YAP/TAZ介導的LXRα抑制是否受經典Hippo通路信號控制，我們分析了肝細胞特異性Lats1/2敲除小鼠的肝臟。在Lats1/2敲除肝臟中，LXRα靶基因表達顯著較低，而Yap/Taz靶基因較高。為了進一步了解YAP/TAZ激活是否損害LXRα的轉錄活性，用T0901317處理了LATS1/2敲除HEK293細胞。RT-qPCR分析證實了組成型激活的YAP/TAZ對LXRα的抑制作用，因為與擴增的CTGF轉錄相反，T0901317未能在LATS1/2敲除細胞中誘導LXRα靶基因表達。

LATS1/2受多種外源性生物物理和生化線索通過上游Hippo通路激酶的調節。我們試圖確定Hippo通路調節是否普遍控制LXRα活性，而不論特定的上游刺激如何。我們證實高細胞密度誘導了原代肝細胞中Yap/Taz的細胞質重定位。高細胞密度，一種已知能降低Yap/Taz活性的條件，顯著增加了小鼠原代肝細胞中LXRα靶基因的轉錄并降低了Yap/Taz靶基因的表達。類似地，血清剝奪產生了類似的效果，證實YAP/TAZ活性的降低通常導致LXRα的去抑制。這些數據表明YAP/TAZ和LXRα之間存在關鍵的相互作用，為堅硬基質如何誘導肝細胞膽固醇蓄積提供了機制見解。

Hippo通路通過YAP/TAZ的核定位來控制其活性，這被LATS1/2介導的多個絲氨酸殘基磷酸化緊密阻止。我們生成了穩定表達5SA-YAP的AML12細胞，這是一種組成型核突變體YAP，其所有LATS1/2磷酸化位點均突變為丙氨酸。正如預期，表達5SA-YAP的細胞有效地阻止了T0901317處理細胞中LXRα促進的膽固醇外流。在野生型細胞中，LXRα靶基因如Abcg1、Abca1、Acaca和Srebf1的表達在T0901317處理后增加。然而，在表達5SA-YAP的細胞中，這些基因的誘導被顯著抑制。報告基因實驗證實，當YAP存在于細胞核中時，LXR反應元件依賴的啟動子活性受到抑制。因此我們測試YAP/TAZ是否與其轉錄伙伴TEAD協同抑制LXRα。鑒于Ser 94對于TEAD結合不可或缺，我們引入了5SA/S94A突變體YAP，它組成型定位于細胞核但不能形成YAP-TEAD異源二聚體進行轉錄激活。出乎意料，5SA/S94A-YAP仍然保留了對LXRα的抑制活性，表明YAP/TAZ可能在細胞核內獨立于其作為轉錄共激活因子的角色，直接與LXRα活性相互作用。

為了進一步理解YAP/TAZ如何干擾LXRα活性，我們研究了LXRα與其不可或缺的異源二聚體伙伴RXRα之間的物理關聯。在野生型細胞中，LXRα按預期與RXRα共免疫沉淀。然而，這種相互作用在LATS1/2敲除細胞中被消除。相反，YAP/TAZ敲除細胞與野生型細胞相比表現出更強的異源二聚體結合，表明YAP/TAZ在細胞核中充當復合物形成的天然抑制劑。值得注意的是，YAP在LATS1/2敲除細胞中也與LXRα共免疫沉淀，這增加了YAP與RXRα競爭結合LXRα的可能性。

與RXRα異源二聚化顯著增加了LXRα的DNA結合親和力，這對于有效調節靶基因表達至關重要。使用抗LXRα抗體的染色質免疫沉淀顯示，LATS1/2敲除細胞中，LXRα與靶基因ABCG1、ABCG5和ABCA1啟動子中LXR反應元件的結合被消除。這表明YAP/TAZ介導的與RXRα的解離導致LXRα的DNA結合受損。使用抗RXRα抗體的額外染色質免疫沉淀實驗顯示，YAP/TAZ也將RXRα從LXRα靶基因的啟動子區域解離。值得注意的是，Yap/Taz敲除肝細胞中LXRα蛋白水平顯著更高，表明Yap/Taz也可能促進LXRα的去穩定化。另一方面，YAP和TAZ的表達在LXRα敲除肝細胞中更高，證明了這些因子之間存在相互抑制的調節關系。這些發現揭示了YAP/TAZ活性破壞LXRα-RXRα異源二聚化、損害LXRα DNA結合并進一步促進其更新的新機制。

基于我們的發現，即硬度增加激活的YAP/TAZ促進膽固醇蓄積，我們假設刪除YAP/TAZ將阻止肝纖維化進展期間的肝細胞膽固醇蓄積。當比較喂食高脂飲食或添加膽固醇的類似飲食的小鼠時，只有高脂高膽固醇飲食顯示顯著的肝纖維化誘導，伴隨著肝臟硬度增加，總膽固醇和游離膽固醇水平顯著誘導。因此，給Yap^fl/fl;Taz^fl/fl小鼠注射AAV8-TBG-Cre病毒以建立肝細胞特異性Yap/Taz敲除小鼠，并進行膽固醇誘導的纖維化模型實驗。病毒注射10天后，基因刪除發生在幾乎所有肝細胞中。YAP表達的敲除也通過免疫印跡得到確認。

喂食高脂高膽固醇飲食12周后，肝臟組織的生化分析表明，Yap/Taz敲除小鼠的肝臟與血清膽固醇比率明顯較低，表明Yap/Taz的缺失導致肝臟膽固醇外流的去抑制。Filipin染色顯示，與野生型小鼠相比，喂食高脂高膽固醇飲食后，Yap/Taz敲除小鼠的肝臟游離膽固醇蓄積顯著抑制。另一方面，在我們的模型中，甘油三酯水平不受Yap/Taz缺失的影響。這表明在纖維化期間，Yap/Taz主要影響膽固醇外流而非脂肪酸儲存。膽固醇誘導的纖維化進展在Yap/Taz敲除小鼠中也顯著延遲，這通過Sirius Red染色得到證實。正如預期，參與膽固醇外流的LXRα靶基因的表達在Yap/Taz敲除小鼠中更高。這也通過免疫印跡和免疫組織化學分析得到證實。由于肝臟中Abcg5/8的敲除會損害膽汁膽固醇分泌并驅動肝臟膽固醇蓄積導致肝損傷，在Yap/Taz敲除小鼠中觀察到的ABCG8表達增加支持了Yap/Taz缺失對膽固醇蓄積的保護作用。為了確定Yap/Taz是否也參與沒有硬度升高的肝內膽固醇水平，我們比較了喂食簡單高脂飲食且未添加膽固醇的小鼠。有趣的是，基因型之間在膽固醇代謝或纖維化進展方面沒有顯著差異。這些表明YAP/TAZ介導的膽固醇調節在機械轉導變得明顯的僵硬肝臟中更為重要。

為了擴展我們在臨床環境中關于YAP/TAZ和LXRα機械敏感性調節的發現，我們分析了來自具有不同程度肝臟硬度的MASLD患者的肝組織。總共229名MASLD患者根據通過瞬時彈性成像測量的肝臟硬度被分為軟、中和硬亞組。肝組織的轉錄組分析顯示，與軟肝臟相比，中和/或硬肝臟中與膽固醇外流相關的LXRα靶基因的轉錄水平顯著降低。相反，YAP/TAZ靶基因隨著硬度增加而顯著上調。肝臟硬度與LXRα靶基因表達之間的負相關證實了我們的發現，即LXRα在肝臟中受到機械調節。有趣的是，當患者根據纖維化分期分組時，無法觀察到這種表達模式，表明肝臟硬度可能作為評估代謝狀態的有價值診斷參數，并得到與肝細胞功能直接機制聯系的支持。免疫組織化學分析證實，與軟肝臟相比，硬肝臟中ABCG8表達較低，YAP活性較高。此外，單細胞RNA測序數據的肝細胞定向分析顯示，肝硬化肝臟中與膽固醇外流相關的LXRα靶基因下調，同時CTGF和CYR61表達增加。總之，我們的結果突出了MASLD患者中硬度相關的肝臟膽固醇蓄積，并揭示了YAP/TAZ對LXRα的機械敏感性抑制是其潛在機制。

硬度增加是肝纖維化的一個標志。然而，關于它如何影響肝細胞功能知之甚少。在本研究中，我們發現基質硬度作為一種調節肝臟膽固醇水平的機械線索。我們對人MASLD肝臟的分析表明，肝內膽固醇與肝臟硬度之間存在強關聯。培養在堅硬水凝膠上的肝細胞自發蓄積更多膽固醇。從機制上講，硬度介導的YAP/TAZ激活通過破壞其與RXRα的異源二聚化來抑制LXRα活性。確實，與野生型小鼠相比，Yap/Taz敲除小鼠對肝臟膽固醇蓄積和纖維化進展更具抵抗力。對MASLD患者肝臟的轉錄組分析進一步證實了LXRα靶基因表達與肝臟硬度及YAP/TAZ靶基因表達之間的負相關。

MASLD中肝纖維化發展的當前觀點是受損肝細胞分泌旁分泌因子激活肝星狀細胞，其中長期定向細胞間通訊導致細胞外基質過度蓄積。由于這個過程，肝臟在肝纖維化進展期間經歷了顯著的重塑，這涉及超出生理范圍的機械特性變化。本研究提出肝臟硬度的變化不僅僅是纖維蓄積的最終表型結果。這些發現突出了一個機械敏感性反饋回路，其中纖維化誘導的硬度加劇了肝細胞膽固醇蓄積和功能障礙，從而進一步加速纖維發生。雖然早期疾病可能對針對脂肪變或炎癥的干預有反應，但伴隨纖維化的機械重塑似乎通過直接損害肝細胞代謝來加強疾病進展。這強調了早期治療干預的臨床重要性，并表明一旦組織硬化發生，針對肝細胞的單一療法可能不足。

根據我們的結果，可以預測對LXRα調節劑等治療的反應可能因肝臟硬度而異。盡管有前景的臨床前證據，但用LXRα配體控制膽固醇水平的臨床嘗試因缺乏療效和不良副作用而未成功。有趣的是，使用另一種核受體激動劑Resmetirom也觀察到類似情況，其療效似乎在晚期纖維化患者中減弱。雖然這主要歸因于不可逆的肝損傷，但我們的發現提出了組織硬化損害核受體信號傳導的可能性，從而導致纖維化肝臟中藥物反應性降低。

我們確定的機械敏感性途徑代表了MASLD干預的潛在治療靶點。當前的治療方法主要側重于代謝干預，例如GLP-1受體激動劑，這些藥物在通過瞬時彈性成像測量肝臟脂肪變和纖維化標志物減少方面顯示出前景。然而，我們的發現表明，靶向機械轉導通路本身可能提供互補的益處。例如，靶向整合素介導的機械信號通路已顯示出治療肝纖維化的前景。因此，目前為癌癥治療開發的YAP/TAZ小分子抑制劑可能被重新用于肝病。此外，靶向機械轉導通路的下游效應物，如特定的膽固醇外流轉運蛋白，可能提供額外的治療方法。

雖然我們的研究為肝臟膽固醇代謝的機械敏感性調節提供了令人信服的證據，但應承認幾個局限性。首先，我們的體外實驗使用了簡化的水凝膠系統，可能無法完全重現纖維化肝臟的復雜機械環境。在纖維化進展期間，肝臟細胞外基質經歷了顯著的成分變化，超出了硬度變化，這可能影響機械轉導途徑。此外，我們的患者隊列僅限于單一民族，需要在不同人群中進行進一步驗證以進行推廣。盡管如此，本研究揭示了一種新的機械敏感性途徑，它創造了一個惡性循環，其中纖維化誘導的硬度促進進一步的膽固醇蓄積和疾病進展，為理解MASLD病理生理學和確定潛在的治療靶點提供了新的見解。將YAP/TAZ確定為調節膽固醇穩態的關鍵肝臟機械傳感器，強調了在肝病發病機制和治療中考慮生物力學因素的重要性，可能導致更有效的靶向纖維化策略。