再生醫(yī)學(xué)為治療腦損傷提供了新希望，但促進(jìn)神經(jīng)元存活與整合仍是挑戰(zhàn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元發(fā)育與修復(fù)中至關(guān)重要，它能釋放生長(zhǎng)因子、促進(jìn)突觸形成和血管生成。本研究探討了將人神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）單獨(dú)或與小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，并利用微流控技術(shù)形成三維（3D）結(jié)構(gòu)后進(jìn)行腦內(nèi)移植的效果。結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系顯著增強(qiáng)了神經(jīng)元的成熟度、存活率和密度。植入小鼠大腦后，共培養(yǎng)物減小了損傷病灶體積，促進(jìn)了軸突生長(zhǎng)，并增強(qiáng)了移植物內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管的耦合。此外，我們發(fā)現(xiàn)NPC和共培養(yǎng)物均能增加植入物中星形膠質(zhì)細(xì)胞的尺寸。高分辨率顯微鏡和光遺傳學(xué)分析證實(shí)了宿主與移植物之間存在功能性突觸連接。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞在促進(jìn)神經(jīng)組織整合和推進(jìn)腦損傷治療中的關(guān)鍵作用。

傳統(tǒng)二維（2D）培養(yǎng)模型難以復(fù)制腦組織的復(fù)雜空間和機(jī)械特性，而三維（3D）結(jié)構(gòu)（如腦類器官和生物打印結(jié)構(gòu)）能更好地模擬大腦的微環(huán)境。微流控技術(shù)則能高通量生成3D結(jié)構(gòu)。然而，現(xiàn)有模型仍難以完全復(fù)制人腦的細(xì)胞復(fù)雜性，神經(jīng)元存活率低，部分歸因于支持細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞）不足的仿生微環(huán)境。本研究旨在通過將人NPC單獨(dú)或與小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)形成的3D結(jié)構(gòu)植入免疫抑制小鼠的大腦皮層，探究星形膠質(zhì)細(xì)胞在促進(jìn)神經(jīng)組織移植和功能恢復(fù)中的關(guān)鍵作用。

研究者假設(shè)，與小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)能增加人胚胎干細(xì)胞（hESC）來源的神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）的活性和神經(jīng)元分化。在二維（2D）單層培養(yǎng)中，與星形膠質(zhì)細(xì)胞以1:3比例共培養(yǎng)4周后，神經(jīng)干/祖細(xì)胞蛋白巢蛋白（Nestin）的表達(dá)降低，而深層神經(jīng)元標(biāo)記物CTIP2陽性的細(xì)胞核數(shù)量增加，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞譜系進(jìn)展和神經(jīng)元分化。qPCR分析顯示，共培養(yǎng)組中神經(jīng)發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子PAX6和BRN2的表達(dá)顯著增加。條件培養(yǎng)基分析發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組培養(yǎng)基中骨橋蛋白（OPN）和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2（IGFBP-2）的表達(dá)顯著上調(diào)。共培養(yǎng)還減少了MAP2+神經(jīng)突的退化。將細(xì)胞懸液注射到新生小鼠運(yùn)動(dòng)皮層后，共培養(yǎng)組中表達(dá)神經(jīng)元核抗原（NeuN）的HuNu+細(xì)胞比例更高，表明神經(jīng)元成熟度增強(qiáng)。

研究者使用定制微流控裝置生成裝載細(xì)胞的Matrigel液滴作為3D結(jié)構(gòu)。在組裝后3天（3 DPA），共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的體積顯著小于NPC單獨(dú)結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞密度更高。活/死細(xì)胞檢測(cè)顯示，在3 DPA和14 DPA時(shí)，共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)中的死細(xì)胞（PI陽性）顯著減少。在28 DPA時(shí)，共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)中成熟神經(jīng)元（NeuN陽性）的比例更高。這些數(shù)據(jù)表明，在3D培養(yǎng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)同樣能提高人細(xì)胞存活率和神經(jīng)元分化。

將微流控生成的3D結(jié)構(gòu)植入到創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）小鼠模型的大腦皮層。大體形態(tài)分析顯示，在損傷后14天（14 DP TBI），NPC植入組病灶明顯，而共培養(yǎng)組病灶最小。在56 DP TBI時(shí)，NPC組仍可見疤痕，而共培養(yǎng)組皮層表面更平滑，病灶面積更小。免疫熒光分析顯示，共培養(yǎng)植入物中有清晰的hNCAM+和HuNu+細(xì)胞簇，而NPC組在14 DP TBI時(shí)未檢測(cè)到植入的hNCAM+細(xì)胞。到56 DP TBI時(shí)，兩組均可見hNCAM+細(xì)胞，但共培養(yǎng)組的植入物體積更小。

分析植入物中星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，無論是NPC還是共培養(yǎng)植入物中的星形膠質(zhì)細(xì)胞，其面積、周長(zhǎng)和復(fù)雜性（通過Sholl分析衡量）均顯著高于對(duì)側(cè)皮層。然而，兩組植入物之間的星形膠質(zhì)細(xì)胞在大多數(shù)參數(shù)上無顯著差異。共培養(yǎng)組中，對(duì)側(cè)皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞尺寸和復(fù)雜性略小。使用S100β標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，兩組植入物中星形膠質(zhì)細(xì)胞密度相似。絕大多數(shù)植入物中的星形膠質(zhì)細(xì)胞為小鼠來源（HuNu陰性）。

星形膠質(zhì)細(xì)胞支持血管發(fā)育并調(diào)節(jié)血腦屏障（BBB）。通過凝集素標(biāo)記血管發(fā)現(xiàn)，兩組植入物中的血管豐度相似。然而，共培養(yǎng)組中星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP+）及其終足標(biāo)志物水通道蛋白4（AQP4）與血管（凝集素+）的共定位面積顯著高于NPC組，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管的物理聯(lián)系更緊密，AQP4在血管上的覆蓋更多，這暗示BBB功能可能得到改善。對(duì)β-肌營(yíng)養(yǎng)不良聚糖的免疫組化分析顯示，NPC植入物中存在異常的、片狀的非極性表達(dá)結(jié)構(gòu)（“旗幟”結(jié)構(gòu)），而共培養(yǎng)組中此類結(jié)構(gòu)面積顯著更小。靜脈注射70 kDa右旋糖酐（FITC標(biāo)記）顯示，兩組植入物血管內(nèi)熒光強(qiáng)度相似，且滲漏極少，表明血管已與宿主整合且功能完整。

評(píng)估植入后56天的宿主組織整合情況發(fā)現(xiàn)，與NPC組相比，共培養(yǎng)組從植入物向外延伸的hNCAM+軸突在鄰近皮層的相對(duì)面積更大，表明更多的軸突長(zhǎng)入宿主組織。對(duì)胼胝體和紋狀體中軸突投射的量化顯示，共培養(yǎng)組單位體積植入物向胼胝體發(fā)出的軸突數(shù)量顯著多于NPC組，而向紋狀體的投射數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

對(duì)體外培養(yǎng)4周的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，hNCAM+神經(jīng)突起與突觸后標(biāo)記物PSD95存在大量重疊。在體內(nèi)，對(duì)從植入物延伸到鄰近皮層的hNCAM+軸突進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其共表達(dá)突觸后蛋白PSD95和突觸前蛋白突觸素（Synaptophysin, Syn）。定量分析表明，NPC和共培養(yǎng)組在hNCAM與PSD95或Syn的重疊百分比上相似，提示來自植入物的軸突正在宿主皮層形成或接收突觸。

為評(píng)估功能整合，研究者在植入前用攜帶ChR2-EYFP的腺相關(guān)病毒（AAV）載體轉(zhuǎn)導(dǎo)3D結(jié)構(gòu)。腦片膜片鉗記錄顯示，光刺激ChR2-EYFP陽性的植入神經(jīng)元能立即誘發(fā)其產(chǎn)生動(dòng)作電位。同時(shí)，在植入物附近的ChR2-EYFP陰性宿主神經(jīng)元中也能記錄到由光刺激植入神經(jīng)元誘發(fā)的去極化反應(yīng)，表明植入神經(jīng)元與宿主神經(jīng)元之間形成了功能性突觸連接。多電極陣列（MEA）記錄進(jìn)一步證實(shí)，光刺激植入物可引發(fā)周圍皮層（最遠(yuǎn)達(dá)700微米）的神經(jīng)元群體產(chǎn)生腦電波活動(dòng)。

本研究表明，小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)的人神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）在體內(nèi)外均產(chǎn)生多重有益效應(yīng)。微流控技術(shù)能規(guī)模化生產(chǎn)可復(fù)制的3D結(jié)構(gòu)，優(yōu)于異質(zhì)性大的類器官。星形膠質(zhì)細(xì)胞提高了植入物的早期留存和穩(wěn)定性，并顯著減小了TBI病灶體積。星形膠質(zhì)細(xì)胞并未增加植入物內(nèi)血管密度，但增強(qiáng)了星形膠質(zhì)細(xì)胞終足與血管的物理聯(lián)系以及AQP4在血管上的定位，可能改善了血管功能。植入物中的星形膠質(zhì)細(xì)胞（主要為宿主來源）尺寸和復(fù)雜性均顯著增加。共培養(yǎng)促進(jìn)了軸突向宿主皮層的延伸，并在胼胝體中觀察到更多的軸突投射。電生理學(xué)證據(jù)證實(shí)了植入神經(jīng)元與宿主神經(jīng)元之間存在功能性連接。

本研究使用異時(shí)性共培養(yǎng)（即發(fā)育較晚的星形膠質(zhì)細(xì)胞與較早的NPC共培養(yǎng)）和異種移植（人細(xì)胞植入小鼠）模型。分析顯示共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中OPN和IGFBP-2表達(dá)上調(diào)。與小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，人星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)在2周時(shí)即顯示出更強(qiáng)的促M(fèi)AP2表達(dá)增加效應(yīng)。宿主來源的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞在植入物中表現(xiàn)出尺寸和復(fù)雜性增加，提示植入物可能分泌促肥大因子。

研究的局限性包括需要評(píng)估長(zhǎng)期效應(yīng)、確定最佳星形膠質(zhì)細(xì)胞來源和移植時(shí)機(jī)、在成年TBI模型中進(jìn)行驗(yàn)證，以及進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試以證明功能恢復(fù)。此外，需考慮免疫排斥問題，本研究使用了免疫缺陷的NSG小鼠以避免此問題。

本研究證明，將星形膠質(zhì)細(xì)胞整合到微流控生成的皮質(zhì)結(jié)構(gòu)中，能增強(qiáng)神經(jīng)元存活與成熟、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和血管整合，從而改善創(chuàng)傷性腦損傷后的修復(fù)效果。未來研究應(yīng)進(jìn)一步評(píng)估最佳的星形膠質(zhì)細(xì)胞來源和移植時(shí)機(jī)，以優(yōu)化治療效果。