有絲分裂過程中的染色體凝縮對于準確的染色體分離至關重要。這一過程由動態的組蛋白修飾驅動，如磷酸化和甲基化。其中，H3S10磷酸化（H3S10ph）和H3K9三甲基化（H3K9me3）是關鍵的有絲分裂特異性修飾。H3K9me3作為異染色質蛋白1（HP1）的結合平臺，協調染色體乘客復合體（CPC）的定位和激活。CPC由Aurora B激酶、INCENP、borealin和survivin組成，確保有絲分裂期間的染色體穩定性。HP1對CPC的早期招募激活了Aurora B，促進H3S10ph，并驅動染色質壓縮。盡管這些修飾已被充分研究，但精氨酸甲基化等其他組蛋白修飾與染色體凝縮之間的相互作用仍未得到充分探索。共激活因子相關精氨酸甲基轉移酶1（CARM1，也稱為PRMT4）已成為細胞周期的關鍵調節因子。在G2/M轉換期間，CARM1在S217和S229位點的磷酸化會抑制其酶活性并觸發其從細胞核轉運到細胞質。然而，CARM1的酶活性抑制在有絲分裂中是否必要尚不完全清楚。染色體凝縮是一個轉錄沉默的過程，需要去除活躍標記并積累抑制性標記。考慮到CARM1產生轉錄活躍標記，如H3R17me2a和H3R26me2a，我們假設CARM1失活對于通過防止這些活躍標記的形成來實現正確的染色體凝縮至關重要。

為研究有絲分裂期間CARM1對組蛋白底物甲基化的動態變化，我們分析了10T1/2細胞（正常小鼠胚胎成纖維細胞）整個細胞周期中組蛋白精氨酸甲基化水平。正如預期，CARM1依賴性標記H3R17me2a和H3R26me2a的水平從G2期開始下降，與有絲分裂進入時CARM1酶活性的抑制相吻合，并在有絲分裂退出后恢復。相反，由PRMT6催化的H3R2me2a在有絲分裂期間增加。重要的是，在H3R2甲基化缺陷突變體（H3R2K或H3R2A）過表達的細胞中，有絲分裂期間H3R17me2a水平的降低不如野生型（WT）細胞明顯。這支持了PRMT6介導的R17甲基化更傾向于發生在R2未甲基化時的觀點。因此，我們假設H3R17me2a和H3R2me2a都會影響H3S10ph和染色體凝縮。在諾考達唑（nocodazole）阻滯的有絲分裂細胞中，CARM1敲低導致H3R17me2a水平更大幅度的降低和H3S10ph水平的同步增加。而PRMT6敲低（降低了H3R2me2a水平）并未顯著影響H3R17me2a水平或導致H3S10ph水平的大幅增加，表明H3R17在H3S10ph中起關鍵作用。實際上，由CARM1敲低或特異性抑制劑（TP-064）引起的H3R17me2a水平降低增加了諾考達唑誘導的H3S10ph水平并縮短了有絲分裂持續時間。這些發現表明，有絲分裂期間CARM1的抑制會降低H3R17me2a，從而引發H3S10ph的增加，促進染色體凝縮。

為了研究H3R17me2a水平下降如何影響H3S10ph水平增加，我們首先檢測了CARM1敲低或過表達（WT或E266Q突變體）細胞中CPC亞基的水平。我們觀察到，只有Aurora B水平隨著CARM1 WT過表達而降低，并隨著CARM1敲低或E266Q過表達而在蛋白和mRNA水平上增加。這表明盡管H3R17me2a是一個公認的活躍標記，但它可能抑制Aurkb轉錄，從而調節Aurora B的豐度。TP-064處理（降低了H3R17me2a水平）增加了Aurora B蛋白和mRNA水平。此外，在CARM1敲除（KO）細胞中，通過WT CARM1（而非ΔNLS-CARM1）拯救來恢復H3R17me2a，導致Aurora B蛋白和mRNA水平降低。直接證據來自過表達H3R17K或H3R17A形式，這增加了Aurora B和H3S10ph水平，導致更快的諾考達唑誘導的有絲分裂停滯和更窄的中期板寬度。相比之下，過表達甲基化模擬物H3R17F或磷酸化缺陷型H3S10A則產生了相反的結果，支持了H3R17me2a減少上調Aurkb轉錄、促進H3S10ph、染色體凝縮和有絲分裂進入的觀點。值得注意的是，Aurora B激酶對其底物的活性并未因H3R17甲基化狀態而改變。總之，這些發現表明，在有絲分裂期間，CARM1抑制導致H3R17me2a減少，進而增加Aurora B表達及其染色質結合，最終提升H3S10ph水平并促進染色體凝縮和有絲分裂進程。

接下來，我們試圖確定H3R17me2a的減少如何增加Aurora B與染色體的結合。考慮到CPC向染色體的招募依賴于H3K9me3結合的HP1與INCENP之間的相互作用，我們首先關注H3R17me2a和H3K9me3之間的交互作用。有趣的是，H3K9me3水平在H3R17甲基化缺陷突變體（H3R17K和H3R17A）中增加，而在H3R17甲基化模擬突變體（H3R17F）中降低。這種模式與我們觀察到的Aurora B表達和H3S10ph水平的變化一致。總體而言，類似于H3R17me2a和H3S10ph之間的關系，整個細胞周期中H3R17me2a和H3K9me3標記的變化呈負相關。即使在CARM1敲低導致H3R17me2a水平降低的情況下，H3K9me3水平也增加了，這強烈表明H3R17甲基化在調節H3K9甲基化中起作用。由于Suv39h1和Suv39h2是催化H3K9me3的已知酶，我們研究了H3R17me2a是否影響它們與染色質的結合。在H3R17me2a水平降低的條件下（CARM1 KO、敲低或抑制），Suv39h2不受影響；然而，Suv39h1更強烈地結合染色質，增加了H3K9me3水平，進而導致Aurora B與染色質結合增加和H3S10ph水平升高。只有在過表達H3R17F的組中，Suv39h1的招募被抑制，隨后H3K9me3以及染色質結合的Aurora B和H3S10ph水平下降。這些發現表明，H3R17me2a和H3K9me3之間的相互作用是通過Suv39h1與染色質的結合介導的。此外，Suv39h1優先催化R17未甲基化的H3上的K9me3，而Suv39h2則不論R17甲基化狀態如何都能誘導K9me3。這一結果表明，H3R17甲基化改變了Suv39h1的底物偏好。總之，這些觀察結果強烈表明，H3R17me2a是通過Suv39h1介導的H3K9me3和隨后的H3S10ph來抑制染色體凝縮和有絲分裂進入的關鍵標記。

雖然我們已經闡明了H3R17me2a的減少如何促進染色體凝縮，但H3R17me2a水平在有絲分裂期間如何動態調節的基本問題仍未得到解答。精氨酸甲基化被認為是體內可逆的過程；然而，真正的精氨酸去甲基化酶（RDM）尚未被鑒定。最近的一項研究表明，某些賴氨酸去甲基化酶（KDM），包括KDM3A和KDM4A，具有RDM活性，盡管主要是在體外。這表明某些KDM的精氨酸去甲基化發生在特定的體內細胞環境中。然后我們檢測了KDM3A、KDM4A、KDM4C、KDM4E、KDM5C、KDM6B、KDM7B或Jumonji結構域蛋白6（JMJD6）是否能在體內使H3R17me2a去甲基化。其中，KDM3A和KDM4A都顯示出強大的RDM活性，代表了其已確立的KDM活性之外的功能擴展。因此，我們將研究重點放在這兩種酶上。過表達KDM3A或KDM4A導致H3R17me2a水平急劇下降，伴隨著Aurkb轉錄增加、諾考達唑處理誘導的H3S10ph水平升高以及明顯的有絲分裂停滯。這些結果與在CARM1缺陷細胞中觀察到的效果非常相似。相反，敲低KDM3A或KDM4A會損害RO-3306釋放后有絲分裂進程中H3R17me2a的減少，導致H3S10ph水平上升較慢，表明有絲分裂進程明顯延遲。總之，這些發現表明KDM3A和KDM4A作為CARM1的對立物，調節H3R17me2a水平，進而影響Aurora B水平和G2/M轉換。

先前的研究表明，重組KDM3A和KDM4A在體外未能使H3R17me2a肽段去甲基化。然而，我們的體內實驗顯示KDM3A和KDM4A表現出RDM活性，有效擦除H3R17me2a標記。基于此，我們假設KDM3A和KDM4A在有絲分裂期間獲得了使H3R17me2a去甲基化的能力。鑒于有絲分裂期間會發生大規模的磷酸化波，我們首先檢查了KDM3A或KDM4A是否在此階段被磷酸化。在G2晚期和有絲分裂期觀察到KDM4A的條帶偏移，表明發生了磷酸化。事實上，KDM4A磷酸化在諾考達唑阻滯的有絲分裂細胞中顯著增加，而KDM3A未檢測到變化。與KDM1A（在有絲分裂期間被磷酸化并從染色質釋放）不同，KDM4A無論其磷酸化狀態如何都保持與染色質結合，這表明KDM4A在整個有絲分裂過程中持續調節染色質動力學。使用Scansite數據庫，我們確定蛋白激酶C（PKC）是負責KDM4A磷酸化的激酶。支持這一預測的是，KDM4A磷酸化在PKC激活劑（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；PMA）處理時增加，并被PKC抑制劑（calphostin C）強烈抑制。這些處理不影響KDM4A的染色質結合能力。值得注意的是，H3R17me2a水平因PMA處理而降低，因calphostin C處理而升高。這些發現表明，PKC介導的KDM4A磷酸化使其能夠使H3R17me2a去甲基化。因此，這種磷酸化導致Aurkb上調和諾考達唑誘導的H3S10ph水平增加。我們的發現提出了一個引人注目的模型：KDM4A在間期作為H3K9me3和H3R2me2a的去甲基化酶發揮作用，但在有絲分裂期間被PKC磷酸化后，它使H3R17me2a去甲基化。此外，正如先前報道的，PKC在有絲分裂期間磷酸化并抑制CARM1，我們通過PKC誘導的CARM1條帶偏移證實了這一點。

Scansite數據庫預測KDM4A的S504是潛在的PKC磷酸化位點，隨后通過質譜分析得到證實。為了研究KDM4A是否通過PKCα介導的S504磷酸化獲得H3R17me2a的去甲基化酶活性，我們構建了KDM4A的磷酸化模擬（S504E）和磷酸化缺陷（S504A）突變體。正如預期，使用免疫沉淀的KDM4A進行的體外去甲基化實驗表明，S504E突變體（而非WT或S504A）在H3R17me2a肽段上誘導了-28 Da的質量偏移，表明發生了精氨酸去甲基化。此外，PMA處理或過表達PKCα-CA突變體誘導了KDM4A WT的磷酸化，但未誘導S504A突變體的磷酸化。PKC激活也未能降低過表達KDM4A S504A的細胞中的H3R17me2a水平，這與KDM4A WT相反。總之，這些結果將S504確定為KDM4A上主要的PKCα依賴性磷酸化位點，并證明了其在賦予H3R17me2a去甲基化酶活性中的關鍵作用。一致地，過表達KDM4A S504E降低了H3R17me2a水平，從而增加了Aurkb轉錄，而過表達S504A則沒有這種效果。KDM4A WT相對溫和的活性可能歸因于細胞環境中上游激酶的部分磷酸化。接下來，我們進行了免疫染色以評估S504的磷酸化如何影響KDM4A的去甲基化酶活性。與WT相比，過表達S504E顯著降低了間期和有絲分裂期的H3R17me2a水平，而過表達S504A則導致H3R17me2a水平升高。相反，H3K9me3水平隨著S504E的過表達而增加，但不隨S504A的過表達而增加。這些結果證實了KDM4A在S504位點的磷酸化對其H3R17me2a去甲基化功能至關重要。

接下來，我們研究了H3K9me3水平如何隨著S504E過表達而進一步增加。這種增加可能是由于KDM4A去甲基化酶活性喪失，抑制了H3K9me3去甲基化，或者是因為H3R17me2a減少增強了Suv39h1結合，促進了H3K9甲基化。為了闡明這些可能性，我們進行了Suv39h1敲低實驗和體外去甲基化實驗。無論S504突變如何，Suv39h1敲低都顯著降低了H3K9me3水平。此外，KDM4A WT、S504E和S504A在體外都能有效地使H3K9me3去甲基化，這表明KDM4A S504E在保留H3K9me3去甲基化活性的同時擦除了H3R17me2a。H3R17me2a水平的降低導致Suv39h1招募到染色質，隨后恢復H3K9me3水平。最后，我們證實了KDM4A在S504位點的磷酸化影響有絲分裂進入。過表達S504E降低了H3R17me2a水平，增加了Aurora B水平，并恢復了H3K9me3水平，從而促進了諾考達唑誘導的有絲分裂停滯。相比之下，過表達S504A則產生相反的效果。總之，我們的研究表明，在有絲分裂期間，PKCα誘導的KDM4A S504磷酸化不僅促進了H3R17me2a去甲基化和Aurkb上調，而且還招募Suv39h1到染色質，導致H3K9me3恢復和隨后的H3S10ph水平增加。這些連續事件促進了完整的染色體凝縮和有絲分裂進入。

這項研究通過闡明染色體凝縮過程中活躍和抑制性組蛋白標記之間的相互作用，為調節有絲分裂的分子機制提供了關鍵見解。具體來說，活躍的組蛋白標記H3R17me2a的水平在有絲分裂早期階段下降，并在后期階段恢復。這與抑制性標記H3K9me3呈負相關，這種精細調控的過程控制了CPC的染色質招募和有絲分裂進程。本研究對文獻的一個關鍵貢獻是闡明了H3R17me2a水平如何下降。通過鑒定KDM3A和KDM4A作為H3R17me2a的去甲基化酶，我們確定了有絲分裂表觀遺傳調控的新參與者。KDM4A在間期使H3K9me3和H3R2me2a去甲基化；然而，在有絲分裂期間，PKCα的磷酸化改變了其底物偏好，使其能夠對H3R17me2a進行去甲基化，并相對降低了對H3R2me2a的活性。這種磷酸化依賴的底物偏好轉變似乎是KDM4A特有的。值得注意的是，KDM3A缺乏與KDM4A S504相當的絲氨酸/蘇氨酸殘基，并且在我們實驗條件下未檢測到KDM3A的磷酸化依賴性變化。然而，包括PhosphoSitePlus和Scansite在內的公共數據庫預測，KDM3A可能在多個殘基（如T308、S446、T668或Y1303）被磷酸化，特別是在G2/M期。這些觀察結果提出了KDM3A活性可能在特定環境中受磷酸化或其他翻譯后修飾（PTM）調控的可能性。闡明這些調控機制可能有助于調和體外和體內去甲基化活性之間的差異，并有助于更全面地理解RDM的生物學作用。研究這些可能性是未來研究的重要方向，也是我們正在進行的重點工作。

在G2/M期，PKCα介導的磷酸化抑制了CARM1依賴的H3R17甲基化，并同時促進了KDM4A介導的H3R17me2a去甲基化，導致H3R17me2a總體水平降低。這些事件增強了Suv39h1向染色質的招募以加載H3K9me3，隨后順序加載H3S10ph，從而完成染色體凝縮。在染色體凝縮涉及的眾多因子中，CPC向染色質的招募起著關鍵作用。在G2晚期，結合在H3K9me3上的HP1將INCENP招募到著絲粒異染色質，隨后是Aurora B介導的H3S10ph，這在一項稱為組蛋白H3甲基-磷酸化開關的過程中將HP1從染色體上置換。在有絲分裂早期，H3R2me2a由PRMT6介導，并將CPC定位在染色體臂上，之后Haspin介導的H3T3ph將CPC重新定位到著絲粒，促進H3S10ph并促進染色體凝縮。在有絲分裂晚期，H3T3ph的去磷酸化和有絲分裂驅動蛋白樣蛋白2將CPC從著絲粒重新定位到中央紡錘體，啟動胞質分裂。盡管額外的組蛋白修飾在有絲分裂期間發生動態變化，但其功能意義仍不清楚。

我們的研究表明，H3R17me2a水平的降低是驅動染色體凝縮的關鍵早期事件，因為它與Aurora B表達增加和Suv39h1向染色質的招募增強相關。H3R17me2a缺失導致Aurora B水平升高的分子機制仍未解決。鑒于H3R17me2a通常與轉錄活躍的染色質相關，其減少可能通過更廣泛的染色質變化間接影響Aurora B mRNA的表達或穩定性，而不是通過直接的調控相互作用。重要的是，我們的發現將H3R17me2a減少定義為連接轉錄相關組蛋白修飾動態與有絲分裂染色質結構的早期染色質轉變。這突出了組蛋白修飾之間的相互作用在協調染色體凝縮和有絲分裂進程中的重要性，強調了組蛋白精氨酸甲基化在有絲分裂控制中的關鍵作用。

10T1/2、MEF和HEK293T細胞在補充了10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的杜爾貝科改良 Eagle 培養基中培養。所有細胞在37°C、5% CO₂的加濕培養箱中維持。

列出了所使用的化學品、構建或獲得的質粒以及用于免疫印跡、免疫沉淀或免疫染色的抗體。

描述了細胞固定、透化、抗體孵育、共聚焦顯微鏡成像以及用于時間推移顯微鏡的GFP-H2B穩定表達細胞系的培養和圖像采集方法。

描述了使用改良的低滲膨脹法進行染色體鋪片以用于免疫染色。

描述了細胞裂解、蛋白質定量、免疫沉淀、SDS-PAGE、轉膜、抗體孵育和ECL檢測的標準方法。

描述了從細胞核中酸提取組蛋白的步驟。

描述了使用免疫沉淀的蛋白（CARM1或PRMT6）與組蛋白肽段及SAM進行的精氨酸甲基化分析，以及使用免疫沉淀的Suv39h1或重組Suv39h1蛋白與總組蛋白提取物及SAM進行的賴氨酸甲基化分析。

描述了使用RO-3306、BI2536或諾考達唑誘導G2/M期停滯，使用諾考達唑處理后用MG132釋放以獲得中期停滯細胞的方法，以及使用PI染色和Alexa Fluor 488偶聯的抗H3S10ph抗體通過流式細胞術分析細胞周期分布和區分有絲分裂細胞。

描述了使用重組Aurora B蛋白與總組蛋白提取物及ATP進行的激酶反應。

描述了總RNA提取、cDNA合成以及使用SYBR Green染料和實時PCR系統進行mRNA表達定量分析的方法。

描述了分離染色質組分的步驟，包括細胞裂解、核分離和染色質提取。

描述了從SDS-PAGE凝膠中切取KDM4A免疫沉淀物條帶、膠內酶解、肽段提取和質譜分析（使用Q Exactive HF-X質譜儀和PRM模式）以鑒定KDM4A在S504位點的磷酸化。

描述了使用免疫沉淀的KDM4A蛋白、H3肽段、α-酮戊二酸、抗壞血酸鈉和硫酸亞鐵銨進行的去甲基化反應，以及使用高效液相色譜-質譜聯用系統分析去甲基化產物。

描述了使用Prism軟件進行統計分析，數據以均值±標準差表示，使用非配對t檢驗比較兩組數據，顯著性水平設定為p < 0.05。