《Advanced Science》：Atrophic Skeletal Muscle-Derived Extracellular Vesicles Transfer miR-125a-5p to Inhibit Bone Formation in Osteoporosis during Aging
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本研究揭示了一條全新的肌-骨內分泌軸，證實衰老過程中萎縮的骨骼肌釋放的細胞外囊泡（EVs）增多，并靶向運輸至骨組織，其攜帶的miR-125a-5p通過抑制前成骨細胞中Sirt7（SIRT7）的表達，進而干擾Sp7（SP7/Osterix）轉錄，最終抑制骨形成。該發現不僅闡明了肌少癥相關骨質疏松的新機制，也為開發同時治療肌萎縮和骨丟失的靶向療法提供了新思路。
2.1 衰老過程中萎縮骨骼肌來源的細胞外囊泡增多并被成骨細胞攝取
衰老常導致骨骼肌萎縮與骨質疏松并存，其核心問題是成骨細胞功能受損導致的骨形成下降。研究發現，隨著小鼠年齡增長，其比目魚肌（SOL）纖維橫截面積（CSA）和收縮功能進行性下降，伴隨骨量減少和成骨細胞功能受損。肌肉纖維CSA與骨密度（BMD）及成骨細胞表面占骨表面積比值（Ob.S/BS）呈顯著正相關，提示衰老中肌肉萎縮與骨丟失緊密關聯。機制上，促進外泌體分泌的關鍵蛋白RAB27A在萎縮肌肉纖維中的表達隨衰老顯著增加。透射電鏡（TEM）顯示老年小鼠肌肉組織中管腔內囊泡（ILVs）數量增多，納米顆粒跟蹤分析（NTA）也證實來自老年肌肉組織的EVs豐度更高。這些EVs表達經典標記物CD9、CD63、CD81和TSG101。通過構建骨骼肌特異性Cd63-eGFP報告基因小鼠（HSACre;Cd63(loxp-eGFP)），研究人員在體內直接追蹤到，衰老過程中肌肉纖維特異性EVs生成增多，并可通過血液循環被骨組織中的成骨細胞攝取，其在成骨細胞中的信號隨年齡增長而增強。
2.2 通過GW4869特異性阻斷骨骼肌中的細胞外囊泡生成可緩解老年小鼠的骨丟失
為了探究抑制肌肉EV生成對骨形成的影響，研究開發了RGDLTTP肽修飾的脂質體（R-LS）用于骨骼肌靶向遞送EV生成抑制劑GW4869（R-LS-GW4869）。體內成像證實該脂質體系統對骨骼肌具有高度選擇性。對老年小鼠進行為期6周的R-LS-GW4869靜脈注射治療后，肌肉來源的EVs顯著減少。微計算機斷層掃描（micro-CT）分析顯示，治療組小鼠股骨遠端的骨微結構改善，骨密度（BMD）和骨小梁數量（Tb.N）升高，骨小梁分離度（Tb.Sp）降低。鈣黃綠素雙標顯示礦化沉積率（MAR）增加，骨鈣素（OCN）免疫組化染色顯示成骨細胞表面增多。體外實驗中，將前成骨細胞與對照肌管、萎縮肌管或經GW4869預處理的萎縮肌管共培養。結果顯示，與萎縮肌管共培養會抑制前成骨細胞中成骨相關基因（Collagen1α1, Runx2, Alpl, Ocn）的表達和堿性磷酸酶（ALP）活性，而這種抑制作用可被GW4869預處理所逆轉。
2.3 衰老骨骼肌來源的細胞外囊泡在體內外抑制骨形成和成骨分化
將老年小鼠來源的衰老骨骼肌EVs（Aged-SKM-EVs）定期靜脈注射給年輕小鼠，持續6周。結果顯示，PKH26標記的Aged-SKM-EVs可被年輕小鼠股骨中的成骨細胞有效內化。Micro-CT分析表明，注射Aged-SKM-EVs的小鼠股骨遠端BMD、Tb.N和骨小梁厚度（Tb.Th）降低，Tb.Sp增加。鈣黃綠素雙標顯示MAR降低，OCN染色顯示成骨細胞活性下降。在體外，用Aged-SKM-EVs處理前成骨細胞，可顯著抑制成骨相關基因的mRNA和蛋白表達，并降低ALP活性。同樣，用萎縮肌管來源的EVs（ATR-EVs）處理前成骨細胞系MC3T3-E1，也觀察到對成骨分化的抑制效應。
2.4 miRNA介導了衰老骨骼肌來源的細胞外囊泡對老年小鼠骨形成的抑制作用
鑒于miRNA是EVs調控受體組織功能的關鍵效應分子，研究通過向老年Dicerfloxp/floxp小鼠注射肌肉肌酸激酶（MCK）啟動子驅動的Cre腺相關病毒（AAV），實現了骨骼肌特異性敲除miRNA生物合成關鍵酶Dicer。結果顯示，肌肉特異性Dicer敲除（DicermKO）顯著改善了老年小鼠的骨微結構，提高了MAR和Ob.S/BS，而肌肉纖維形態未受影響。這表明Aged-SKM-Es中攜帶的miRNAs介導了其對成骨作用的抑制。
2.5 miR-125a-5p在肌少癥患者血漿細胞外囊泡中富集并介導對成骨分化的抑制
通過對非肌少癥和肌少癥老年患者的血清EVs進行小RNA深度測序，并結合萎縮肌管來源EVs（ATR-EVs）的測序數據，篩選出miR-125a-5p和miR-222-3p為共同上調的miRNA，其中miR-125a-5p豐度更高。qPCR驗證證實，miR-125a-5p在肌少癥患者的肌肉組織、老年小鼠的肌肉組織、Aged-SKM-Es、老年小鼠血清EVs以及萎縮肌管及其來源EVs中均顯著上調。在功能上，在共培養體系中加入miR-125a-5p抑制劑，可以逆轉ATR-EVs對前成骨細胞成骨分化的抑制作用，恢復成骨基因表達和ALP活性。
2.6 功能獲得與缺失實驗證實骨骼肌中的miR-125a-5p在衰老過程中抑制骨形成
利用肌肉靶向肽（RGDLTTP）修飾的重組腺相關病毒（MyoAAV）載體，在老年小鼠骨骼肌中特異性過表達或沉默miR-125a-5p。結果表明，肌肉特異性過表達miR-125a-5p會加劇肌肉萎縮，并導致股骨遠端BMD、Tb.N、Tb.Th下降，Tb.Sp升高，MAR和Ob.S/BS降低。相反，利用“海綿”（sponge）載體沉默肌肉中的miR-125a-5p，則能促進骨形成，緩解年齡相關的骨丟失和肌肉萎縮。在年輕小鼠中過表達miR-125a-5p也重現了誘導肌萎縮和抑制骨形成的表型。
2.7 miR-125a-5p通過靶向SIRT7介導的Sp7去乙酰化抑制成骨分化并阻礙骨形成
在機制層面，研究發現miR-125a-5p能直接抑制前成骨細胞中Sirt7的表達。雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-125a-5p可直接結合Sirt7mRNA的3‘非翻譯區（3’-UTR）。過表達miR-125a-5p會顯著抑制成骨分化，而共轉染Sirt7過表達質粒則可逆轉此抑制效應。進一步研究揭示，SIRT7能直接結合并去乙酰化Sp7基因啟動子區域，從而促進Sp7的轉錄。過表達Sirt7能上調Sp7mRNA水平，而使用去乙酰化酶抑制劑則會抑制Sp7的轉錄。因此，miR-125a-5p通過靶向抑制Sirt7，破壞了SIRT7介導的對Sp7啟動子的組蛋白去乙酰化作用，最終導致Sp7轉錄活性下降和成骨分化受損。
3 討論
本研究系統闡明了一條在衰老過程中由萎縮骨骼肌主動抑制骨形成的全新內分泌通路。衰老骨骼肌釋放的EVs增多，通過循環系統靶向骨組織，并將其攜帶的關鍵miRNA貨物——miR-125a-5p遞送至成骨譜系細胞。miR-125a-5p通過直接靶向抑制Sirt7，干擾了SIRT7依賴的Sp7啟動子去乙酰化和轉錄激活，從而抑制成骨分化，導致骨形成減少和骨丟失。這一軸線的發現，不僅深化了對肌少癥與骨質疏松共病機制的理解，也提示靶向Aged-SKM-EVs或miR-125a-5p-SIRT7-SP7通路，可能成為同時治療肌肉萎縮和骨質疏松的潛在新策略。研究的局限性包括未完全解析EVs中的其他衰老相關因子、臨床樣本僅包含男性、以及GW4869對EV亞群抑制的非特異性等，未來研究需在這些方面進行深入探索。
