衰老是所有高等生物普遍的生物學(xué)過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致主要器官系統(tǒng)的進(jìn)行性退化。隨著人口老齡化趨勢(shì)加劇，老年人心臟功能障礙的患病率持續(xù)上升。心臟衰老的標(biāo)志之一是線粒體功能障礙，特別是受損的線粒體自噬——一種負(fù)責(zé)降解受損線粒體的選擇性自噬過(guò)程。年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致氧化磷酸化效率下降，活性氧（ROS）生成增加，破壞線粒體動(dòng)力學(xué)并進(jìn)一步阻礙線粒體自噬。受損的線粒體自噬在年齡相關(guān)性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。嘌呤能受體家族，尤其是P2X7受體（P2X7R），是一種ATP依賴性三聚體離子通道，在調(diào)節(jié)鈣信號(hào)和炎癥反應(yīng)中起重要作用，在多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。然而，P2X7R在心臟衰老中的作用和潛在機(jī)制研究仍然有限。

本研究首先評(píng)估了不同年齡（年輕、中年、老年）人群血清中的P2X7R水平，發(fā)現(xiàn)P2X7R表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)顯著上調(diào)。在自然衰老的小鼠中，P2X7R在心臟組織中的表達(dá)也顯著升高。免疫熒光染色顯示，在老年小鼠心臟組織中，P2X7R與α-輔肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性的心肌細(xì)胞共定位，表明其在心臟衰老過(guò)程中主要表達(dá)于心肌細(xì)胞。在體外，用D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞衰老，P2X7R表達(dá)呈濃度依賴性增加。使用P2X7R藥理抑制劑A438079可顯著抑制衰老標(biāo)志物p21、p53和p16的表達(dá)，并減少衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）陽(yáng)性細(xì)胞，提示P2X7R可能是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

為了研究P2X7R在心臟衰老中的潛在作用，研究人員使用了全身性P2X7R基因敲除（P2X7R^-/-）小鼠。與同齡野生型（WT）老年小鼠相比，P2X7R^-/-老年小鼠毛發(fā)更密更光滑。超聲心動(dòng)圖評(píng)估顯示，WT老年小鼠出現(xiàn)顯著的心功能不全和心臟肥厚，而P2X7R缺陷顯著減輕了這些年齡相關(guān)的心臟損傷。組織學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)，P2X7R缺陷顯著改善了WT老年小鼠出現(xiàn)的心臟結(jié)構(gòu)異常、心臟纖維化和心肌細(xì)胞橫截面積增加。此外，P2X7R缺陷有效降低了心臟組織中衰老蛋白p21、p53和p16的表達(dá)，SA-β-Gal染色也顯示出一致趨勢(shì)。這些發(fā)現(xiàn)表明，P2X7R缺陷延緩了小鼠衰老，并改善了衰老引起的心臟異常。

線粒體異常是衰老的關(guān)鍵病理標(biāo)志。透射電鏡評(píng)估顯示，WT老年小鼠心臟組織中線粒體明顯腫脹、嵴丟失，而P2X7R缺陷有效逆轉(zhuǎn)了這些線粒體超微結(jié)構(gòu)異常。對(duì)血清丙二醛（MDA）含量和心肌組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的評(píng)估表明，WT老年小鼠血清MDA水平顯著升高，心肌SOD活性降低，這些改變可被P2X7R缺陷所削弱。同時(shí)，促炎因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β）在WT老年小鼠心臟組織中水平顯著升高，而在P2X7R^-/-老年小鼠中這些升高被消除。對(duì)線粒體自噬關(guān)鍵蛋白水平的評(píng)估顯示，與WT年輕小鼠相比，WT老年小鼠心臟組織中PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1（PINK1）-PARK2（Parkin）通路活性和LC3-II表達(dá)顯著降低，而Sequestosome-1， SQSTM1（P62）表達(dá)升高，提示心臟線粒體自噬受損。值得注意的是，這些與衰老相關(guān)的線粒體自噬缺陷可被P2X7R缺陷所減輕。

為探究P2X7R介導(dǎo)心臟衰老和線粒體自噬受損的潛在分子機(jī)制，研究人員進(jìn)行了心臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。在差異最顯著的基因中，核受體亞家族4組成員A1（NR4A1）因其在調(diào)控衰老和線粒體自噬中的已知作用而成為關(guān)鍵候選基因。在衰老小鼠心臟組織和D-gal刺激的HL-1心肌細(xì)胞中，NR4A1蛋白表達(dá)均顯著下降，而P2X7R缺陷或抑制可逆轉(zhuǎn)這種下降。隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，抑制NR4A1活性會(huì)加劇D-gal誘導(dǎo)的衰老表型和受損的線粒體自噬，而過(guò)表達(dá)NR4A1則能顯著改善D-gal誘導(dǎo)的衰老表型并恢復(fù)線粒體自噬功能。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，P2X7R過(guò)表達(dá)顯著加劇了D-gal誘導(dǎo)的衰老表型和線粒體自噬受損，而這些效應(yīng)可被NR4A1過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)表明，P2X7R通過(guò)抑制NR4A1來(lái)抑制線粒體自噬，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老。

為了闡明心臟特異性P2X7R–NR4A1軸在心臟衰老和線粒體自噬中的作用，研究人員使用攜帶心臟特異性啟動(dòng)子（cTnT）的腺相關(guān)病毒血清型9（AAV9）在心肌細(xì)胞中特異性過(guò)表達(dá)P2X7R或NR4A1。在D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠模型中，心肌細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)P2X7R顯著加劇了心臟功能障礙和心臟肥厚，而同時(shí)過(guò)表達(dá)NR4A1則能明顯減輕這些不良反應(yīng)。心臟結(jié)構(gòu)、心臟纖維化、心肌細(xì)胞橫截面積、心臟衰老和線粒體自噬等相關(guān)指標(biāo)也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。這些結(jié)果共同表明，NR4A1是心肌細(xì)胞特異性P2X7R促進(jìn)心臟衰老的下游效應(yīng)因子。

研究發(fā)現(xiàn)，NR4A1蛋白水平的下降幅度遠(yuǎn)大于其mRNA水平的變化，提示調(diào)控可能涉及翻譯后修飾。在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中，E3連接酶是關(guān)鍵。通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)集的分析和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)三結(jié)構(gòu)域蛋白26（TRIM26）的mRNA和蛋白水平在衰老的WT心臟中顯著上調(diào)，但在衰老的P2X7R^-/-心臟中下降。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TRIM26與NR4A1存在物理相互作用。在HL-1心肌細(xì)胞中，沉默TRIM26會(huì)增加NR4A1蛋白水平，而過(guò)表達(dá)TRIM26則會(huì)降低NR4A1蛋白水平。環(huán)己酰亞胺追蹤實(shí)驗(yàn)顯示，TRIM26促進(jìn)NR4A1蛋白降解。使用蛋白酶體抑制劑MG132能有效逆轉(zhuǎn)TRIM26介導(dǎo)的NR4A1降解，而自噬抑制劑則無(wú)效，表明NR4A1蛋白是通過(guò)蛋白酶體途徑降解的。此外，在TRIM26沉默的細(xì)胞中，NR4A1的泛素化水平顯著降低。這些結(jié)果共同表明，TRIM26直接結(jié)合NR4A1并通過(guò)泛素化促進(jìn)其降解。

P2X7R在mRNA和蛋白水平上均調(diào)控TRIM26的表達(dá)。研究人員推測(cè)，P2X7R缺失導(dǎo)致的TRIM26表達(dá)下降可能源于合成減少或mRNA降解增加。mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，P2X7R拮抗劑A438079縮短了TRIM26 mRNA的半衰期，提示P2X7R影響TRIM26 mRNA的穩(wěn)定性。RNA結(jié)合蛋白HuR是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，通常通過(guò)結(jié)合靶標(biāo)mRNA 3‘非翻譯區(qū)（UTR）中的AU富集元件（ARE）或U富集基序發(fā)揮作用。有趣的是，TRIM26 mRNA的3‘UTR中存在多個(gè)ARE或U富集基序，這是HuR的潛在結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-gal處理促進(jìn)了HuR從核到質(zhì)的穿梭，增加了其與TRIM26 mRNA的結(jié)合，從而穩(wěn)定并上調(diào)了TRIM26表達(dá)，而這些效應(yīng)可被A438079顯著消除。值得注意的是，HuR的總蛋白水平和mRNA水平在體內(nèi)外均未發(fā)生顯著變化，表明P2X7R介導(dǎo)的心臟衰老僅涉及HuR核質(zhì)穿梭的改變。RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，HuR直接結(jié)合WT老年小鼠心臟組織中的TRIM26 mRNA，而這種相互作用在P2X7R缺陷后顯著減少。這些結(jié)果表明，P2X7R特異性誘導(dǎo)HuR核穿梭，從而增加HuR與TRIM26 mRNA的結(jié)合，最終改變心肌細(xì)胞中TRIM26的表達(dá)。

本研究首次闡明了P2X7R在心臟衰老中先前未被認(rèn)識(shí)的作用。首先，發(fā)現(xiàn)人類血清P2X7R水平隨年齡增長(zhǎng)而逐步升高，而老年小鼠心臟P2X7R表達(dá)上調(diào)與心功能下降和線粒體自噬受損相吻合。其次，P2X7R缺陷減輕了衰老誘導(dǎo)的心臟重塑和功能障礙，改善了老年心臟的衰老特征并恢復(fù)了有缺陷的線粒體自噬。相反，心肌細(xì)胞特異性P2X7R過(guò)表達(dá)加劇了D-gal誘導(dǎo)的心臟功能障礙，加速衰老，并進(jìn)一步破壞了D-gal誘導(dǎo)的線粒體自噬。第三，研究證明P2X7R通過(guò)促進(jìn)HuR的核質(zhì)穿梭來(lái)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞線粒體自噬，從而增加TRIM26 mRNA穩(wěn)定性并促進(jìn)NR4A1的泛素化介導(dǎo)的降解，最終抑制線粒體自噬。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明P2X7R通過(guò)調(diào)節(jié)HuR/TRIM26/NR4A1軸和損害線粒體自噬，成為心臟衰老的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。

盡管本研究提供了P2X7R在心臟衰老中的新見解，但仍存在一些局限性。例如，循環(huán)P2X7R水平與心臟P2X7R表達(dá)的相關(guān)性仍需在人類心臟組織中進(jìn)行直接驗(yàn)證。全身性P2X7R敲除模型觀察到的心臟衰老益處可能涉及非心肌細(xì)胞群的貢獻(xiàn)，未來(lái)需要使用心肌細(xì)胞特異性條件性敲除模型來(lái)明確P2X7R信號(hào)在衰老心臟中的細(xì)胞自主作用。此外，P2X7R激活如何與HuR的核質(zhì)穿梭相關(guān)聯(lián)，其具體分子機(jī)制仍有待完全確定。最后，研究?jī)H使用了雄性小鼠，這顯著限制了研究結(jié)果的普遍性。性激素等因素可能影響P2X7R信號(hào)傳導(dǎo)、NR4A1功能或?qū)δ挲g相關(guān)線粒體自噬下降的整體易感性。

綜上所述，利用P2X7R敲除小鼠和特異性抑制劑，本研究闡明了P2X7R通過(guò)損害心肌細(xì)胞線粒體自噬來(lái)介導(dǎo)衰老誘導(dǎo)的心臟功能障礙。該研究（1）提供了人類血清P2X7R水平與年齡正相關(guān)的直接證據(jù)；（2）揭示了P2X7R在介導(dǎo)小鼠衰老誘導(dǎo)的心臟改變中先前未被認(rèn)識(shí)的關(guān)鍵作用；（3）闡明了一種新機(jī)制，即P2X7R通過(guò)HuR/TRIM26/NR4A1軸促進(jìn)心臟衰老，從而調(diào)節(jié)ROS水平和心臟線粒體自噬。這些發(fā)現(xiàn)為老年小鼠心臟功能障礙的分子事件提供了新見解，并證明P2X7R過(guò)表達(dá)會(huì)加劇心臟衰老，揭示了P2X7R是年齡相關(guān)心功能下降的潛在新型治療靶點(diǎn)。