初級(jí)纖毛是廣泛存在于多種細(xì)胞類型（如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞）表面的突出細(xì)胞器，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其形成和功能缺陷與多種病理狀況相關(guān)，包括神經(jīng)發(fā)育缺陷、衰老和癌癥。傳統(tǒng)上，對(duì)細(xì)胞樣本中纖毛化細(xì)胞的評(píng)估依賴于熒光/共聚焦顯微鏡下對(duì)免疫標(biāo)記纖毛標(biāo)志物后的視覺評(píng)估和計(jì)數(shù)。盡管已有先進(jìn)的圖像分析工具來協(xié)助這一費(fèi)力的評(píng)估，但該方法仍可能受操作者依賴性因素的影響，且可計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量有限。本研究探索了一種替代方法——利用流式細(xì)胞術(shù)和成像流式細(xì)胞術(shù)來分析攜帶纖毛的人類神經(jīng)祖細(xì)胞。

研究使用了從野生型人iPSC系和攜帶CPLANE1突變的iPSC系分化產(chǎn)生的神經(jīng)祖細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于玻片或懸浮液中，通過免疫熒光染色標(biāo)記纖毛標(biāo)志物。使用的關(guān)鍵抗體包括針對(duì)軸絲標(biāo)志物ARL13B和基底體標(biāo)志物PERICENTRIN（PCNT）的一抗及相應(yīng)的熒光二抗。為驗(yàn)證方法特異性，還使用了另一纖毛相關(guān)標(biāo)志物INPP5E。為誘導(dǎo)纖毛減少，部分細(xì)胞用10 mM CaCl₂處理20分鐘。

分析采用了三種方式：1）傳統(tǒng)的熒光顯微鏡觀察（使用Leica SP8或DM6B顯微鏡）和基于ImageJ的手動(dòng)計(jì)數(shù)；2）流式細(xì)胞術(shù)分析（使用BD FACS Lyric或BD FACS Aria III流式細(xì)胞儀），數(shù)據(jù)用Floreada軟件分析；3）成像流式細(xì)胞術(shù)分析（使用Amnis ImageStreamX Mark II），以提供空間分辨率確認(rèn)信號(hào)定位。

首先，研究測試了使用抗ARL13B抗體（綠色熒光）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測纖毛化細(xì)胞的可行性。結(jié)果顯示，流式細(xì)胞儀能清晰檢測到陽性細(xì)胞群體，與僅二抗對(duì)照相比信號(hào)明顯偏移。通過成像流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞離心涂片后的顯微鏡觀察，確認(rèn)了該信號(hào)特異性定位于細(xì)胞膜上的纖毛，與傳統(tǒng)顯微鏡在貼壁培養(yǎng)中觀察到的模式一致。

接著，研究結(jié)合了ARL13B（軸絲標(biāo)志物）和PCNT（基底體標(biāo)志物）進(jìn)行雙重標(biāo)記。雙重標(biāo)記在傳統(tǒng)免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中均產(chǎn)生清晰可見的陽性信號(hào)。成像流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，兩個(gè)標(biāo)志物的信號(hào)共定位于細(xì)胞膜上的單個(gè)斑點(diǎn)。所有ARL13B⁺的細(xì)胞均為PCNT⁺，而部分PCNT⁺細(xì)胞為ARL13B^?，這與顯微鏡觀察結(jié)果一致，并確認(rèn)了ARL13B是纖毛檢測更具區(qū)分性的標(biāo)志物。使用ARL13B和INPP5E的共同染色也驗(yàn)證了纖毛檢測的特異性。

為驗(yàn)證方法的檢測能力，研究比較了未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞和經(jīng)CaCl₂處理（已知可降低纖毛化細(xì)胞百分比）的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，處理樣本的纖毛化細(xì)胞比例確實(shí)低于對(duì)照，該結(jié)果與對(duì)同一樣本進(jìn)行的顯微鏡分析結(jié)果一致（處理后分別降低15%和22%）。

最后，該方法被用于分析來自CPLANE1基因突變（與Joubert綜合征相關(guān)）iPSC的神經(jīng)祖細(xì)胞，并與健康對(duì)照進(jìn)行比較。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，CPLANE1突變細(xì)胞系的纖毛化細(xì)胞比例與對(duì)照相比顯著降低，這與此前基于AcTUBULIN和PCNT免疫染色的研究觀察相符。

傳統(tǒng)的纖毛化細(xì)胞頻率測量依賴于視覺評(píng)估和計(jì)數(shù)，耗時(shí)且易受操作者變異影響。近年來雖有半自動(dòng)化圖像分析方法的報(bào)道，但仍需采集大量圖像，且對(duì)高密度簇狀生長的神經(jīng)祖細(xì)胞培養(yǎng)物而言，精確的纖毛成像和分割存在挑戰(zhàn)。

本研究首次成功利用流式細(xì)胞術(shù)檢測并分析了完整、纖毛化的人類神經(jīng)祖細(xì)胞群體。通過使用抗ARL13B和抗PCNT抗體分別標(biāo)記軸絲和基底體，并利用成像流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)信號(hào)特異性，首次證明了這種基于單細(xì)胞的檢測模式適用于纖毛化細(xì)胞群體的評(píng)估。ARL13B標(biāo)記比中心粒相關(guān)的PCNT更具區(qū)分性，且對(duì)軸絲特異。

與傳統(tǒng)的基于顯微鏡的纖毛計(jì)數(shù)方法相比，流式細(xì)胞術(shù)在樣本通量和測量準(zhǔn)確性方面具有顯著優(yōu)勢。每個(gè)樣本可通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估的細(xì)胞數(shù)量比現(xiàn)有顯微鏡方法高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，從而提供更具代表性的數(shù)據(jù)。對(duì)大量細(xì)胞樣本進(jìn)行熒光信號(hào)的客觀測量，克服了在選定視野內(nèi)視覺計(jì)數(shù)纖毛所固有的操作者依賴性偏差。因此，流式細(xì)胞術(shù)的速度和高通量特性特別適合于量化大細(xì)胞樣本中的纖毛化細(xì)胞頻率，以獲得統(tǒng)計(jì)可靠的數(shù)據(jù)集。此外，流式細(xì)胞術(shù)可同時(shí)測量多個(gè)熒光通道，為結(jié)合表型、增殖或細(xì)胞周期標(biāo)志物（如細(xì)胞周期蛋白、Ki67、PCNA）以及其他與熒光讀數(shù)兼容的細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)志物（例如衰老或凋亡測定）來進(jìn)一步表征纖毛化亞群提供了可能。

流式細(xì)胞術(shù)分析的樣本可并行制備細(xì)胞離心涂片，為纖毛染色的特異性和表型提供互補(bǔ)的定性對(duì)照。或者，使用成像流式細(xì)胞術(shù)可以增加精確的空間分辨率，提供即時(shí)的信號(hào)定性驗(yàn)證。這種先進(jìn)模式可能特別有利于尋找新的纖毛發(fā)生調(diào)節(jié)劑的藥物篩選，并可為使用纖毛化細(xì)胞測量評(píng)估神經(jīng)發(fā)育疾病表型的臨床前研究提高通量。特別是，基于纖毛病患者樣本體外模型的轉(zhuǎn)化研究，可以利用這種標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀設(shè)置即可實(shí)現(xiàn)的單細(xì)胞流式模式。通過流式細(xì)胞術(shù)識(shí)別并可能分選纖毛化細(xì)胞以進(jìn)行進(jìn)一步表征的能力，將可能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育疾病研究的新實(shí)驗(yàn)策略和建模。

本研究結(jié)果首次證明，流式細(xì)胞術(shù)可用于以定量、高通量、操作者非依賴性的模式檢測神經(jīng)祖細(xì)胞上的初級(jí)纖毛，為簡化和改進(jìn)纖毛化細(xì)胞群體的研究開辟了新的可能性。