隨著環境保護和生物多樣性監測的需求日益增長，科學家們找到了一種“基因偵探”般的方法——環境DNA（eDNA）技術。簡單來說，生物在環境中生活時，會通過脫落細胞、排泄物等方式留下含有自身遺傳物質的痕跡。從水、土壤或空氣中收集這些痕跡并進行DNA分析，就能知道哪些生物曾經或正在那里出沒，而無需直接看到或捕捉到它們。這種方法尤其適用于廣闊而難以全面調查的水域，比如海洋。目前，最常用的eDNA分析方法是“宏條形碼”（metabarcoding）。它有點像給所有生物“點名”：先通過聚合酶鏈式反應（PCR）大量擴增某個特定的基因片段（如同一個通用“條形碼”），然后進行測序和比對，從而識別出存在哪些物種。這種方法非常靈敏，尤其擅長檢測特定的目標類群。

然而，宏條形碼技術有一個“先天不足”——PCR擴增過程。不同的DNA片段在PCR中的擴增效率并不均等，這會導致最終結果無法真實反映環境中各種生物DNA的原始比例，產生所謂的“擴增偏好性”。為了解決這個問題，另一種被稱為“鳥槍法測序”（shotgun sequencing）的技術進入了研究者的視野。這種方法不經過特異性PCR擴增，而是將環境樣本中所有的DNA隨機打斷成小片段進行測序，理論上能更全面地反映樣本的原始遺傳組成。但理想很豐滿，現實卻很骨感。在以往的研究中，鳥槍法測序得到的海量數據里，絕大部分序列都來自數量龐大的細菌等原核生物，而研究者更關心的魚類、無脊椎動物等真核生物（尤其是后生動物）的序列則被淹沒其中，檢測效率遠不如宏條形碼。

那么，有沒有辦法讓鳥槍法測序更“偏愛”真核生物一些呢？研究團隊將目光投向了eDNA研究的第一步——水樣過濾。eDNA在環境中以多種形態存在，從完整的細胞、組織碎片到游離的DNA，大小不一。而過濾使用的濾膜，其孔徑大小就像一個“篩子”，決定了能留住哪些大小的顆粒。他們猜想：既然細菌等原核生物的細胞通常較小（約0.1–5.0 μm），而真核生物的細胞或細胞器通常較大（約1–100 μm），那么使用更大孔徑的濾膜，是不是就能相對多地留住真核生物的eDNA，同時讓更多的小尺寸原核生物DNA“溜走”，從而在后續的鳥槍法測序中提高真核生物序列的比例呢？為了驗證這個大膽的假設，一項精巧的實驗在丹麥哥本哈根的Skovshoved港展開。

研究人員的主要技術方法包括：在同一個地點采集海水樣本，使用五種不同的濾膜（四種不同孔徑（0.2、1.2、5.0、8.0 μm）的非封閉式濾膜和一種0.2 μm孔徑的封閉式Sterivex濾膜）分別過濾1升海水，每種濾膜設置三個生物學重復。隨后，對同一樣本平行進行兩種分析：一是高通量鳥槍法測序，以全面分析所有遺傳物質；二是針對真核生物18S核糖體RNA（rRNA）基因的宏條形碼測序，作為傳統方法的對照。數據通過BLASTn比對NCBI數據庫進行物種分類，并運用一系列生物信息學和統計學方法（如非度量多維尺度分析（nMDS）、優勢比（OR）計算、Wilcoxon檢驗等）比較不同孔徑濾膜對物種組成的影響。

研究獲得了海量的測序數據，但最終能比對到數據庫并達到嚴格質量控制標準的序列，僅占總序列的很小一部分（約0.78%）。盡管如此，結果清晰地揭示了濾膜孔徑的強烈效應。如圖1所示，小孔徑濾膜（0.2和1.2 μm）捕獲的序列中以細菌為主（平均占63%），真核生物比例較低（平均28%）；而大孔徑濾膜（5.0和8.0 μm）則顯著提高了真核生物序列的比例（平均49%），同時降低了細菌的比例（平均31%）。統計檢驗表明，小孔徑濾膜能獲得更多的古菌和細菌讀長，而大孔徑濾膜能獲得更多的真核生物和病毒讀長。在檢測到的19個后生動物門中，除一個門外，其余所有門在大孔徑濾膜中的豐度都更高。

作為對比，18S rDNA宏條形碼分析，如其預期，只檢測到真核生物。雖然其測序深度足夠，且在門水平上檢測到的真核生物多樣性也很高，但其結果并未像鳥槍法數據那樣，顯示出濾膜孔徑對群落組成的清晰、一致的影響模式。

在真核生物門水平的多樣性上，兩種方法表現出了高度的相似性。總共54個真核生物門中，有39個是兩種方法共同檢測到的。鳥槍法測序獨檢測到9個門，宏條形碼獨檢測到6個門。這種差異可能源于PCR擴增偏好性、數據庫覆蓋度不同或真實的生物學原因。此外，非度量多維尺度分析（nMDS）圖清晰地顯示，基于鳥槍法數據，不同孔徑的樣本在群落組成上能明顯區分開，而宏條形碼數據中的這種區分模式則較弱。這突顯了鳥槍法測序在揭示采樣方法（如濾膜孔徑）對eDNA捕獲影響方面的優勢。

為了評估鳥槍法測序用于生物監測的潛力，研究人員選取了四個研究較為充分的海洋后生動物類群（魚類（Actinopterygii）、雙殼類（Bivalvia）、多毛綱環節動物（Polychaeta）、軟甲綱甲殼動物（Malacostraca）），在屬水平上比較了兩種方法檢測到的已知存在于丹麥的“本地屬”與“外來源屬”（后者很可能源于數據庫不全導致的錯誤比對）的比例。結果顯示，對于多毛綱、軟甲綱和雙殼類，鳥槍法檢測到的屬中本地屬比例較高；但對于魚類，本地屬比例較低（23/59）。相比之下，宏條形碼數據在所有類群中顯示出更高的本地屬比例。值得注意的是，在鳥槍法數據中，分配給外來源屬的讀長數量遠低于本地屬，尤其是在有利于后生動物捕獲的大孔徑濾膜樣本中。這提示，通過設置合理的讀長數量閾值，或許能在鳥槍法數據中有效區分可信的本地物種檢測與可能的錯誤識別。

本研究的核心結論是：增大水樣過濾時使用的濾膜孔徑，可以顯著提高鳥槍法測序數據中真核生物（尤其是后生動物）eDNA序列的比例，有效緩解原核DNA的掩蓋問題。 這為優化旨在進行鳥槍法測序的eDNA采樣方案提供了直接且實用的指導——當研究目標主要是真核生物時，考慮使用更大孔徑（如5.0或8.0 μm）的濾膜。

研究同時表明，在門級分類水平上，鳥槍法測序所揭示的真核生物多樣性與傳統的18S宏條形碼方法高度吻合，甚至略有超越（檢測到更多獨特的門），證明了其在廣度上的可靠性。然而，研究也坦誠指出了當前鳥槍法測序應用于eDNA監測的兩大主要瓶頸：一是公共參考基因組數據庫的不完善，導致大量序列無法被準確分類到種、屬甚至科級水平；二是生物信息學分析流程復雜且計算量大。

盡管如此，這項研究為未來指明了方向。隨著諸如“地球生物基因組計劃”（Earth Biogenome Project）等大規模測序項目的推進，參考數據庫將飛速擴展。同時，更高效的比對算法（如k-mer based方法）也在不斷發展。結合本研究提出的優化采樣策略（使用大孔徑濾膜），鳥槍法測序有望克服當前局限。相較于宏條形碼，它具有無PCR擴增偏好性、能反映更真實的相對豐度信息、以及全基因組范圍覆蓋的潛力。因此，研究人員認為，鳥槍法測序值得被進一步開發和評估，以期在未來為水生生物多樣性監測提供更準確、更全面的工具。 論文最終發表在《Metabarcoding and Metagenomics》期刊上，為eDNA技術領域提供了重要的方法論見解。