2017年，中國廣東省的一個農場發生了大規模的腹瀉疫情，新生仔豬在出生后五天內死亡率約為90% [1]。受影響的仔豬表現出嚴重腹瀉、嘔吐和脫水癥狀，哺乳母豬也出現了腹瀉癥狀，導致重大經濟損失 [1]，[2]。致病因子被鑒定為一種新的豬腸道冠狀病毒，從腹瀉仔豬的腸道樣本中分離出來，隨后被命名為豬腸道α冠狀病毒（PEAV）。PEAV也被稱為豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）或豬腸道α冠狀病毒（SeACoV） [1]，[2]。PEAV是一種有包膜的單鏈正鏈RNA病毒，基因組長度約為27,000個堿基對。在分類學上，它屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）中的α冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）[3]。其基因組由5′和3′非翻譯區（UTRs）包圍，這些區域編碼ORF1a/ORF1b多聚蛋白、四種結構蛋白（刺突蛋白[S]、包膜蛋白[E]、膜蛋白[M]和核衣殼蛋白[N]，以及三種輔助蛋白（NS3a、NS7a、NS7b）[1]，[4]。

基于全基因組測序的系統發育分析顯示，PEAV與2004年至2006年間在廣東和香港發現的四種蝙蝠腸道α冠狀病毒（HKU2-CoV）株具有約95%的核苷酸同源性，強烈表明其起源于蝙蝠 [1]，[5]，[6]。由于蝙蝠已被確定為人畜共患冠狀病毒（如嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒[SARS-CoV]（通過果蝠）和中東呼吸綜合征冠狀病毒[MERS-CoV]（通過駱駝）的宿主，PEAV的跨物種傳播潛力引起了重大關注 [7]。體外研究表明，PEAV具有廣泛的物種嗜性，在豬、家禽、非人靈長類動物以及嚙齒類動物（大鼠、小鼠、沙鼠和倉鼠）的細胞系中能夠高效復制 [8]。實驗感染證實，C57BL/6J小鼠通過口服和腹腔注射途徑均易感 [8]。值得注意的是，PEAV還能感染多種人類細胞系（Huh-7.5、CaCo2、ST-INT、HRT、HepG2/C3A、293T、A549、HeLa）[8]，[9]以及原代人類肺/腸道細胞（如微血管內皮細胞、氣道上皮細胞），這突顯了其人畜共患風險 [9]，[10]。臨床上，PEAV引起的豬腹瀉與其他主要腸道冠狀病毒（如豬流行性腹瀉病毒[PEDV]和豬δ冠狀病毒[PDCoV]引起的腹瀉無法區分，這凸顯了開發特定診斷工具的迫切需求，以便及時控制疫情并防止進一步傳播。

目前的PEAV診斷方法分為基于核酸的檢測方法和免疫檢測方法。基于核酸的方法根據反應原理進一步分為依賴熱循環的擴增技術和等溫擴增技術。依賴熱循環的方法，如基于TaqMan的實時RT-PCR [11]，[12]和滴液數字PCR（ddPCR）[13]，因其高靈敏度和定量準確性而受到重視。然而，這些方法需要復雜的熱循環儀、較長的周轉時間（≥60分鐘）和熟練的操作人員，限制了其在資源有限的環境（如養豬場或當地獸醫站）中的應用。相比之下，基于等溫擴增的核酸檢測方法，包括重組酶聚合酶擴增（RPA）熒光檢測 [14]、實時逆轉錄環介導的等溫擴增（RT-LAMP）[15]和微流控RT-LAMP芯片 [16]，專為現場使用設計。這些方法在恒定溫度（37–65°C）下運行，無需熱循環設備，可在30–40分鐘內完成擴增。然而，它們也存在一些缺點：RPA在常溫條件下的試劑穩定性有限，溫度耐受性窄；而RT-LAMP及其微流控衍生物由于多引物設計容易發生非特異性擴增 [16]。相比之下，免疫檢測方法（如間接ELISA [17]）操作簡單且成本低，但靈敏度較低，不適合病毒載量較低的早期診斷。鑒于現有診斷方法的這些局限性，迫切需要開發一種兼具高靈敏度、強特異性、操作簡便性和現場適應性的PEAV檢測工具，以滿足快速現場診斷的需求。

在上述等溫擴增技術中，RPA是一種經典原型，它利用重組酶（一種單鏈DNA結合蛋白）和鏈置換DNA聚合酶來擴增核酸 [14]，[18]。重組酶輔助擴增（RAA）是一種優化的商業變體，保留了RPA的核心機制，同時解決了其關鍵限制——即溫度耐受性窄和試劑穩定性差的問題。RAA具有更寬的操作溫度范圍（通常為37–45°C）、更快的擴增動力學（≤30分鐘）和在常溫條件下的更好試劑穩定性 [19]，[20]，[21]，[22]，使其特別適合資源有限的現場環境。基于這些優勢，我們選擇RAA作為PEAV診斷檢測的擴增模塊。此外，CRISPR/Cas系統由CRISPR序列和相關Cas蛋白組成，最初在細菌和古菌中作為適應性免疫機制，用于防御外來遺傳物質 [23]，[24]。該系統利用CRISPR RNA引導Cas內切酶（如Cas12a）特異性切割目標DNA [25]。重新用于核酸檢測后，CRISPR/Cas12a表現出目標激活的轉切割活性，能夠非特異性切割單鏈DNA報告分子，從而實現熒光或側向流動讀數 [25]，[26]，[27]。然而，單獨使用CRISPR/Cas12a檢測通常靈敏度有限且反應動力學較慢。通過將其與等溫擴增技術（如RAA）結合，可以克服這一限制，創造出針對SARS-CoV-2、非洲豬瘟病毒、PEDV和Cladobotryum mycophilum等病原體的高靈敏度檢測平臺 [28]，[29]，[30]，[31]，[32]。將RAA與CRISPR/Cas12a結合的一個關鍵挑戰是模板DNA和RAA擴增產物可能會過早激活Cas12a的順式切割活性，導致引物降解和擴增效率降低 [33]，[34]。目前解決這一問題的策略通常需要將擴增和檢測步驟物理分離，這增加了操作復雜性，延長了檢測時間，并增加了氣溶膠污染的風險，這些都是臨床應用的重大障礙。

在這項研究中，我們分析了所有公開可用的PEAV菌株的完整基因組，并確定了N基因中的一個高度保守的約231 bp區域作為最佳診斷靶標。利用這一靶標，我們開發了一種雙讀數RT-RAA-CRISPR/Cas12a檢測方法，結果可通過便攜式藍光設備或側向流動試紙條（LFD）解讀。為了減少氣溶膠污染并簡化工作流程，我們設計了一種創新反應裝置，其中RAA擴增在外層1.5 mL管中進行，而Cas12a檢測試劑預先裝載在內層管中。擴增后輕輕渦旋即可釋放內層試劑，實現封閉管一步檢測。這種設計保持了簡單性和低污染風險，同時顯著提高了效率和靈敏度，為現場PEAV核酸檢測提供了可靠的解決方案。