無需提取的一步法重組酶聚合酶擴增技術——利用狂熱火球菌（Pyrococcus furiosus）Argonaute蛋白進行Epstein-Barr病毒（EB病毒）的快速高效檢測
《Microchemical Journal》：Extraction-free one-pot recombinase polymerase amplification-
Pyrococcus furiosus Argonaute assay for rapid and sensitive detection of Epstein-Barr virus
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基于重組酶聚合酶擴增（RPA）和Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）的提取-free單管式檢測方法，實現EB病毒的高靈敏度（1拷貝/μL）和特異性檢測，適用于現場即時診斷和資源有限場景，檢測時間短于1小時。
宋夏|曹娜|郝盼盼|朱琳琦|史偉峰|周偉|吳志云
中國江蘇省常州市蘇州大學第三附屬醫院臨床實驗室
摘要
Epstein-Barr病毒（EBV）是首個被發現的人類致癌皰疹病毒，與多種惡性腫瘤和自身免疫性疾病有關。傳統的分子診斷技術（如PCR和qPCR）具有高靈敏度，但需要復雜的核酸提取過程、精密的設備以及訓練有素的操作人員，這限制了它們在即時檢測（POCT）中的應用。本文報道了一種無需提取、一管完成重組酶聚合酶擴增-Pyrococcus furiosus Argonaute（RPA-PfAgo）檢測方法，可用于快速且超靈敏地檢測EBV。在該方法中，擴增和檢測過程整合在一個封閉的試管內進行：RPA步驟在37°C下進行目標序列擴增，隨后在95°C下通過PfAgo介導的切割反應完成。采用石蠟分離技術實現擴增產物與檢測產物的分離，從而防止交叉污染并確保操作流程的順暢性。通過優化RPA-Ago酶用量、引導DNA濃度、Mn2?水平及孵育時間等反應參數，達到了最高的檢測效率。該方法的檢測限為1拷貝/μL，并且未發現與其他病毒或細菌病原體的交叉反應。使用31份臨床血液樣本進行的驗證顯示，其檢測結果與qPCR結果完全一致。這項研究首次提出了一種無需提取、僅需一個試管即可完成EBV檢測的RPA-PfAgo方法，檢測時間僅需一小時。其操作簡便、靈敏度高，并且可在藍光下直接讀取結果，非常適合現場檢測和資源有限的診斷環境。此外，這一技術為將基于PfAgo的生物傳感方法擴展到其他傳染病提供了通用平臺，為傳統的核酸檢測方法提供了一種實用且經濟高效的替代方案。
引言
Epstein-Barr病毒（EBV），也稱為人類皰疹病毒4型（HHV-4），于1964年首次在Burkitt淋巴瘤中被發現，是最早被發現的人類致癌病毒。EBV屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）中的Gammaherpesvirinae亞科，是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，直徑約為150–200納米，基因組大小約為180 kb，編碼80–100種蛋白質[1]。EBV感染幾乎普遍存在，全球成年人的血清陽性率超過95%，并且會終生存在于B淋巴細胞中[2][3]。除了潛伏無癥狀攜帶狀態外，EBV還與多種疾病相關，包括淋巴瘤、鼻咽癌、某些胃癌、傳染性單核細胞增多癥、口腔毛狀白斑病、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化癥[4]。據估計，EBV每年導致約2%的全球癌癥相關死亡病例[5]。目前已開發出多種EBV檢測方法。血清學檢測仍被廣泛使用，用于監測針對病毒衣殼抗原（VCA）、早期抗原（EA）和核抗原（EBNA）的特異性抗體反應[6]。然而，在免疫功能低下的個體中，由于抗體產生受損或被動獲得抗體，血清學檢測的可靠性較低，這限制了其在移植受者等脆弱人群中的診斷價值。受影響組織的組織病理學檢查是EBV相關疾病（如移植后淋巴增生性疾病PTLD）確診的金標準，但該方法具有侵入性、耗時且操作復雜[7][8][9][10]。因此，核酸擴增檢測已成為EBV診斷的核心方法，能夠敏感定量地評估外周血中的病毒載量，從而支持疾病監測和指導預防性治療[7][11][12][13][14][15]。傳統的基于PCR的方法（包括定量PCR qPCR）雖然準確度高，但需要昂貴的儀器和專業的操作人員，限制了其在資源有限或即時檢測場景中的應用[16]。近年來，等溫擴增技術（如環介導等溫擴增LAMP和重組酶聚合酶擴增RPA）被積極探索作為替代方案[17]。其中，RPA因其快速的擴增動力學、較低的操作溫度和簡單的引物設計要求而受到關注。然而，RPA容易發生非特異性擴增，可能導致假陽性結果并降低分析的可靠性。
為提高檢測特異性，過去五年中RPA常與CRISPR/Cas系統結合使用[18][19][20]。這些方法利用序列特異性識別和熒光報告分子的切割，實現高靈敏度的核酸檢測。盡管CRISPR基檢測方法具有優勢，但它們通常依賴RNA引導的核酸酶，這些核酸酶易降解、價格較高且對反應條件敏感。最近，Argonaute（Ago）蛋白作為可編程核酸酶的新選擇出現[21][22][23]。Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）是一種可編程的內切酶，能夠根據短5′-磷酸化引導DNA精確切割單鏈DNA[24][25]。與CRISPR系統相比，PfAgo不需要protospacer序列，且由DNA而非RNA引導，具有更高的靈活性和更低的成本。盡管最近的研究表明基于PfAgo的檢測方法具有高特異性（甚至可達到單堿基分辨率），但大多數報道的平臺仍需多步驟操作，這引發了關于氣溶膠污染的擔憂，并限制了其在即時檢測中的應用[26][27]。
在本研究中，我們開發了一種無需提取、密封在一管內完成重組酶聚合酶擴增-Pyrococcus furiosus Argonaute（RPA-PfAgo）檢測的方法，用于快速靈敏地檢測EBV DNA（圖1）。通過簡短的熱裂解步驟后，RPA擴增和PfAgo介導的檢測過程在空間上被分離，隨后通過溫度控制整合在一個封閉的試管內完成，實現了無需打開試管即可完成擴增和信號生成。該方法具有高靈敏度和特異性，檢測限與qPCR相當，并在臨床樣本中表現出可靠的性能。由于其簡化的工作流程、封閉式擴增-檢測設計以及最低的設備要求，這種一管RPA-PfAgo平臺為即時檢測和資源有限的診斷環境提供了實用的方法。
臨床樣本和預處理
樣本來自蘇州大學第三附屬醫院腫瘤科和血液科的患者，在一年的時間內收集，并儲存在-20°C條件下直至分析。本研究采用匿名化的臨床樣本進行回顧性分析。研究方案已獲得蘇州大學第三附屬醫院倫理委員會的批準（批準編號2026–033），并免除了知情同意的要求。
RPA-PfAgo方法原理
RPA-PfAgo檢測的整體流程如圖1所示。檢測過程包括四個步驟：樣本預處理、基于RPA的擴增、PfAgo介導的切割以及熒光信號讀取。通過對不同EBV亞型的比較分析，選擇了一個在大多數EBV序列中都存在的保守片段（位于BamHI-W區域，長度為286 bp）。此外，計算機模擬分析確認了BamHI-W目標區域的高度保守性。
討論
Epstein-Barr病毒（EBV）由于其致癌潛力以及與多種疾病（從傳染性單核細胞增多癥到鼻咽癌和移植后淋巴增生性疾病）的關聯，仍然是一個重要的臨床病原體[29][30]。準確的實驗室診斷不僅對臨床管理至關重要，也對流行病學監測具有重要意義。長期以來，定量PCR（qPCR）因其高靈敏度而被視為EBV檢測的金標準。
結論
總之，我們開發了一種快速、靈敏且高度特異的RPA-PfAgo檢測方法，用于EBV的檢測。通過將等溫擴增與PfAgo介導的切割整合在一個封閉的試管中，該方法實現了真正的封閉系統流程，最大限度地減少了污染并將檢測時間縮短至一小時以內。該方法操作簡單，不需要復雜設備，并且檢測結果可在藍光下直接觀察。
CRediT作者貢獻聲明
宋夏：撰寫初稿、方法設計、概念構思。曹娜：驗證、數據整理、撰寫初稿。郝盼盼：數據可視化、實驗分析、撰寫初稿。朱琳琦：驗證、軟件開發、數據整理、撰寫初稿。史偉峰：項目監督、資源協調、概念構思、審稿與編輯。周偉：軟件開發、資源管理、項目行政、實驗分析、審稿與編輯。吳志云：撰寫、審稿
資助
本研究得到了中國博士后基金會（2024M760297）和常州市科技項目（應用基礎研究，項目編號CJ20252028）的資助。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
