《Ecology and Evolution》：Soil Microbial Functions Indicate Persistent Agricultural Legacies and Potential Alternative States Following Restoration Plantings
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本研究應用宏基因組學評估農業廢棄地修復造林后的土壤微生物功能恢復情況。研究發現，雖然功能多樣性未變，但功能組成在修復地與原始地間差異顯著，這與土壤磷（P）含量等遺留效應相關。原始土壤中磷代謝功能多樣性更高，表明微生物對貧瘠土壤的適應。研究提示，單純的植被修復難以完全恢復微生物功能，可能需要針對微生物組（如土壤接種）或直接處理非生物遺留問題（如種植吸磷植物）的干預措施。
文章內容歸納總結
1 引言
在農業廢棄地上有效恢復自然生態系統對于應對全球生物多樣性下降至關重要。然而，修復工作常面臨因耕作導致的土壤結構同質化以及數十年施肥造成的土壤養分遺留等非生物性質改變的挑戰。這些遺留效應可能阻礙地上和地下生態系統成分的恢復。因此，評估土壤微生物群落及其生態功能在修復后的恢復情況，為衡量修復干預措施的有效性提供了重要的監測手段。
土壤微生物群落對修復造林表現出復雜的響應模式。一些研究表明，在修復干預數十年后，微生物群落仍未恢復，而另一些研究則更常見地顯示出恢復的趨勢，盡管這種恢復往往是不完全的。評估微生物群落可以為了解生態演替和恢復軌跡提供線索，但由于微生物類群間存在高度的功能冗余以及類群間存在水平基因轉移，群落組成的缺乏恢復并不能直接推斷其功能的缺乏恢復。這表明，即使分類學組成未能完全恢復，功能恢復仍可能發生。
越來越多的研究使用基于單基因的擴增子或環境DNA（eDNA）宏條形碼技術來評估修復后微生物群落的恢復。然而，由于功能冗余和水平基因轉移的存在，僅憑分類學身份無法可靠預測微生物的功能角色，因此這類方法對理解驅動恢復的生態過程提供的見解有限。鳥槍法宏基因組學通過直接測序和量化微生物基因組，克服了這些限制，能夠更全面地評估土壤功能潛力及微生物介導的過程，如養分循環、有機物分解和初級生產力。在澳大利亞西南部等養分貧瘠的生態系統中，微生物功能多樣性尤為重要，它支持植物-微生物相互作用，并適應磷限制。因此，宏基因組學方法為評估生態系統恢復和恢復力提供了強大的工具。
本研究采用鳥槍法宏基因組學，對澳大利亞西南部六個農業廢棄地修復點四種土地條件下的土壤微生物群落及其功能進行了表征。我們測試了以下假設：（i）微生物分類多樣性和組成在土地條件間存在差異；（ii）微生物功能基因的組成和多樣性在土地條件間存在差異；（iii）與磷循環相關的功能在不同土地條件下表現出不同的恢復模式。
2 材料與方法
本研究在澳大利亞西南部的六個地點進行，該地區屬全球生物多樣性熱點。研究區域為地中海氣候，土壤普遍貧瘠。每個地點均包含四種土地條件：從未被清除或耕作的原始植被、被動再生的歷史清除地、通過直接播種主動再植被的農用地、以及作為防火帶或通道管理的退化地。在每個樣地內，系統采集表層土壤樣品，用于DNA提取和理化分析。
使用商業試劑盒提取土壤DNA并制備文庫，隨后在MGI DNBSEQ G400測序儀上進行鳥槍法宏基因組測序。使用Kraken2和Bracken進行物種分類學注釋，使用SUPER-FOCUS直接對過濾后的讀長進行原核基因功能注釋，并參照SEED數據庫對功能進行分類。
所有統計分析均在R中完成。使用方差分析比較不同土地條件間的α多樣性（有效物種/功能數）。使用基于Bray-Curtis距離的非度量多維標度排序和置換多元方差分析檢驗群落和功能組成的差異。使用約束對應分析評估群落/功能組成與土壤理化性質之間的關聯。針對選定的功能組（特別是磷代謝），采用相同的分析框架，并進行差異豐度和相關性分析，以識別具體的磷代謝功能差異。
3 結果
分析共產生了包含13,940個獨特微生物物種的分類學數據庫，以及包含35,276個獨特功能的功能數據庫。物種和功能的α多樣性（有效數量）在四種土地條件間均未表現出顯著差異。
然而，微生物分類學組成和功能組成均因土地條件和地點而異。特別是在所有功能中，原始土壤和再植被土壤的功能組成表現出明顯差異。微生物群落組成與硝酸鹽、pH、磷、硫、鋁和鐵等土壤性質相關，而功能組成則與硝酸鹽、pH、磷和硫相關。
在子系統1水平上，氨基酸及衍生物、碳水化合物、基于聚類的子系統、DNA代謝以及調控與細胞信號轉導等功能的相對豐度在不同土地條件間存在差異。對于磷代謝功能，原始土壤擁有最高的磷代謝功能多樣性，顯著高于退化和再植被土地條件。磷代謝功能的組成在不同地點間存在差異，并與磷、硝酸鹽、銅、pH和硫等土壤性質相關。盡管可用磷水平在不同土地條件間的差異未達統計顯著性，但原始土壤的磷含量普遍較低，而再植被土壤則高出2-3倍。磷代謝功能多樣性與土壤磷水平呈中度負相關。
差異豐度分析顯示，與原始土壤相比，再植被、退化和再生土壤中兩種特定的磷代謝基因（與膦酸鹽利用相關的乙酰轉移酶和核糖-1,5-二磷酸磷酸激酶PhnN）豐度降低。
對于其他評估的功能組，僅DNA代謝功能組的有效功能數在原始與再植被條件間存在差異。大多數功能組的組成在不同土地條件和地點間存在差異，并與多種土壤非生物性質相關，但關聯模式不如磷代謝功能清晰。
4 討論
研究表明，修復農業景觀中的土壤微生物功能是一項重大挑戰。我們發現功能α多樣性在不同土地條件間一致，但功能組成存在差異，尤其是在再植被土壤和原始土壤之間。這些組成差異與土壤非生物遺留效應（特別是磷的有效性）密切相關。
原始土壤中磷代謝功能多樣性更高，表明在養分限制條件下，微生物群落經過長期選擇，具備了更廣泛的磷獲取功能潛力。相反，磷含量較高的再植被和退化土壤中，這些途徑的多樣性減少，這與微生物傾向于使用能耗較低的無機磷酸鹽而非膦酸鹽的策略一致。兩種參與膦酸鹽降解的特定磷代謝基因在修復后土壤中豐度降低，很可能反映了由于殘留磷水平較高，微生物從低磷獲取策略發生了轉變。這些發現表明，盡管原始土壤總體磷功能多樣性最高，但微生物群落利用的具體代謝途徑在農業后的土地條件下存在差異，這可能影響磷循環動態和長期的生態系統恢復。
我們證實了多種土壤非生物性質與微生物群落和功能組成密切相關。總體功能多樣性雖無差異，但細微的組成變化表明，再植被土壤中的功能仍與原始生態系統不同。這些差異不一定反映“缺乏恢復”，而可能代表了在存在未解決的土地利用遺留問題的修復地點，出現了與替代狀態一致的、改變了的功能動態。
如果修復項目的目標是完全恢復至原始狀態的功能，則可能需要通過有針對性的土壤移植/接種和/或生物刺激策略來解決這些限制因素。此外，未來需要使用基于RNA的宏轉錄組測序來研究功能表達，并整合多界生物（如真菌）的方法。
磷代謝多樣性與可用磷水平之間的強關聯表明，農業后的非生物遺留效應持續塑造著微生物功能，制約著長期的養分循環和植物-微生物相互作用。因此，修復工作不應僅關注植被恢復，還應關注促進微生物功能恢復的策略。從原始生態系統引入微生物群落的土壤接種，或通過積聚磷的植物來減少土壤磷含量等干預措施，可能有助于恢復干擾前的土壤條件和功能組成。然而，這些方法的有效性取決于微生物在改變的土壤條件下的定植和持久性，以及開發降低土壤有效磷的實用技術。這些不確定性凸顯了進一步研究的必要性，以探索如何克服土地利用遺留效應，并識別農業廢棄地景觀中微生物功能恢復的生態和非生物限制因素。
