《Ecology and Evolution》：Weathering the Storm: Legacies of Extreme Meteorological Events and Daily Weather Variability Shape the Skin Microbiota of the Endangered Golden Alpine Salamander Salamandra atra aurorae (Trevisan, 1982)
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本文首次揭示了極端風暴（Vaia, 2018）與日常天氣波動對瀕危金阿爾卑斯蠑螈皮膚微生物群的顯著影響。研究發現，風暴破壞區域蠑螈皮膚菌群中的潛在病原菌（如 Aeromonas hydrophila）豐度顯著升高，且其細菌群落β多樣性（Bray-Curtis dissimilarity）更低。同時，采樣時的天氣條件（晴天vs降雨）對菌群α多樣性（Chao1指數、Faith's phylogenetic diversity）和β多樣性（Bray–Curtis、Jaccard等）均有顯著影響，解釋了最高達9%的細菌群落變異。本研究強調了自然擾動與日度天氣變化在塑造兩棲動物皮膚微生物群、進而影響其健康與病原體抵御能力中的關鍵作用，為脆弱物種（如金阿爾卑斯蠑螈）的保護策略提供了重要的微生物學視角。
1 引言
全球生態系統正經歷前所未有的變化，兩棲動物種群因此遭受由棲息地喪失和新發病原體驅動的災難性衰退。皮膚微生物群是兩棲動物抵御病原體的重要第一道防線。金阿爾卑斯蠑螈（Salamandra atra aurorae, Trevisan, 1982）是一種高度地方性、瀕危的兩棲動物亞種，其分布范圍不超過26 km2。2018年發生的Vaia風暴對包括其整個分布區在內的超過42,000公頃森林造成了嚴重風倒破壞。本研究首次描述了該亞種皮膚微生物群的細菌和真菌組成，并利用Vaia風暴造成的棲息地擾動作為獨特機會，探究極端天氣事件與日常天氣波動是否會改變其皮膚微生物群的多樣性和組成，從而影響其對環境變化的適應力。
2 材料與方法
2.1 極端天氣事件：Vaia風暴
2018年10月27日至30日期間，Vaia極端氣象事件以近200 km/h的風速和72小時內超過600 mm的降水量肆虐意大利東北部森林。
2.2 研究區域
研究區域位于意大利特倫托自治�。≒AT）的Vezzena高原（海拔1450米）。在7.8公頃的森林內設置了33個20米×20米的樣地（plot）進行長期監測。根據2018年風暴后是否有樹木風倒，將樣地劃分為“受影響”（impacted）或“未受影響”（non-impacted）。
2.3 環境變量
通過衛星影像和氣象站數據，評估了受影響與未受影響樣地在空氣溫度、歸一化植被指數（NDVI）和歸一化水體指數（NDWI）上的差異。計算了每個樣地在風暴前后（2017年與2022年）立木百分比的差異以評估樹木損失。
2.4 蠑螈樣本采集
2022年7月26、28和29日，共捕獲56只金阿爾卑斯蠑螈（44只來自12個未受影響樣地，12只來自2個受影響樣地）。記錄了每只個體的總長度、性別（雄性/雌性/妊娠雌性）等信息。使用無菌水沖洗后，用拭子對每只蠑螈進行全身30次皮膚擦拭采樣，并將拭子于-20°C保存。
2.5 分子方法與測序
使用DNeasy Blood and Tissue Kit提取DNA。分別針對16S rRNA基因V3-V4區（細菌）和ITS1區（真菌）進行PCR擴增。擴增產物純化后，在Illumina MiSeq PE300平臺上進行雙端測序，每個樣本目標覆蓋度約10萬條reads。
2.6 生物信息學分析
使用DADA2（v.1.16.0）進行序列質控和處理。使用SILVA（v.138.1）數據庫為細菌ASV（amplicon sequence variants）分配分類學，使用UNITE數據庫（General Fasta v.9.0）為真菌ASV分配分類學。使用decontam包（v.1.24.0）和陰性對照進行文庫去污染。使用SRS（scaling with ranked subsampling）方法進行數據標準化。
2.7 統計分析
使用線性混合模型（LMM）測試環境變量在樣地類型和Vaia時間點前后的差異。使用LDA效應量（LefSe）方法檢測受影響與未受影響樣地間皮膚微生物群細菌和真菌屬水平的差異豐度。針對潛在病原菌Aeromonas hydrophila，使用Mann-Whitney U檢驗比較其相對豐度。使用Chao1、Shannon熵、逆辛普森指數和Faith's系統發育多樣性指數計算α多樣性，并使用廣義線性混合模型（GLMM）分析其與樣地類型、采樣天氣、優勢樹種和性別的關系。使用Bray–Curtis相異度、Jaccard指數以及非加權和加權UniFrac距離評估β多樣性，并使用PERMANOVA和PERMDISP進行分析。
3 結果
3.1 環境變量
在所有樣地中，風暴后的NDVI（植被覆蓋度）顯著高于風暴前，NDWI（地表水含量）則顯著低于風暴前。但受影響與未受影響樣地之間，在空氣溫度、NDVI或NDWI上均未發現顯著差異。與蠑螈不存在的樣地相比，蠑螈存在的樣地NDWI顯著更低（表明環境更干燥）。
3.2 蠑螈樣本
捕獲的蠑螈數量、性別比、妊娠雌性比例、體重和體長在受影響與未受影響樣地之間均無顯著差異。
3.3 皮膚微生物群組成
共獲得6,596,108條reads，鑒定出12,397個細菌ASV和2,149個真菌ASV。
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細菌：最豐富的門是變形菌門（Proteobacteria，占70.0%），其次是擬桿菌門（Bacteroidota，10.5%）和放線菌門（Actinobacteriota，9.0%）。最豐富的屬是Acinetobacter（19.3%）和Pseudomonas（17.1%）。
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真菌：最豐富的門是子囊菌門（Ascomycota，64.4%）和擔子菌門（Basidiomycota，22.5%）。最豐富的屬是Lophodermium（11.1%）和Cladosporium（6.4%）。未檢測到壺菌（Batrachochytrium spp.）。
LefSe分析顯示，與未受影響樣地相比，受影響樣地的蠑螈皮膚微生物群中，5個細菌屬（Acidicapsa, Aeromonas, Alloprevotella, Oerskovia, Pseudarthrobacter）和3個真菌屬（Herpotrichia, Lachnum, Rhizidium）的相對豐度顯著更高；5個真菌屬（Exobasidium, Hormonema, Lachnellula, Parafenestella, Piskurozyma）的相對豐度則更低。特別值得注意的是，導致紅腿病（red-leg syndrome）的潛在致病菌Aeromonas hydrophila在受影響樣地蠑螈中的相對豐度中位數顯著更高。
3.4 皮膚微生物群α多樣性
樣地類型（是否受風暴影響）與細菌或真菌α多樣性無顯著關聯。然而，天氣條件顯著影響細菌α多樣性：在降雨條件下，細菌的豐富度（Chao1指數）和系統發育多樣性（Faith's PD）均顯著低于晴天條件。真菌α多樣性（尤其是群落均勻度，逆辛普森指數）在受影響樣地有更低趨勢，但在校正協變量后不顯著。
3.5 皮膚微生物群β多樣性
受影響樣地蠑螈的皮膚細菌β多樣性（Bray-Curtis、Jaccard、加權/非加權UniFrac）在所有指標上均顯著低于未受影響樣地，表明其細菌群落組成在個體間差異更小。
天氣是影響皮膚微生物群β多樣性最強、最一致的因素，最高可解釋9%的細菌群落變異和6%的真菌群落變異。細菌β多樣性在晴天（包括雨后）更高，而真菌β多樣性則在雨天更高。
性別不影響微生物群β多樣性。優勢樹種對真菌群落β多樣性有邊際效應。
PERMDISP分析表明，天氣條件和樣地類型顯著影響細菌和真菌群落β多樣性的離散度（dispersion）。
在整個研究區域內，細菌群落的相似性（基于Bray-Curtis距離）與樣地空間鄰近性呈顯著正相關。而真菌群落未顯示出顯著的地理結構。
4 討論
Vaia風暴及日常天氣波動均能影響金阿爾卑斯蠑螈的皮膚微生物群。風暴影響區域蠑螈皮膚中潛在病原菌A. hydrophila豐度升高，且細菌β多樣性降低（群落同質化），這可能削弱其對病原體的抵抗力并增加疾病易感性。真菌群落的響應模式與細菌不同，部分與腐爛植物材料相關的真菌（如Oerskovia）豐度在受影響區域增加，可能與風暴后木材殘骸增加有關。
日常天氣（特別是降雨）對微生物群α和β多樣性有顯著影響，表明微生物群對濕度和降水等瞬時環境因素高度敏感。這可能是由于真菌孢子擴散和細菌在不同濕度條件下粘附能力的差異所致。
盡管未檢測到空氣溫度、NDVI和NDWI在受影響與未受影響樣地間的顯著差異，但風暴引發的冠層開口、紫外線暴露、蒸氣壓力虧缺以及土壤成分等微生境變化，可能通過影響環境微生物庫或宿主行為間接塑造了皮膚微生物群。
鑒于金阿爾卑斯蠑螈分布范圍狹窄、繁殖率低、種群數量自風暴后急劇下降，保護策略應考慮極端天氣事件和微氣候條件對其皮膚微生物群（作為健康指標）的潛在影響。維持穩定的微生境、足夠的濕度水平以及通過可控的森林管理減輕棲息地擾動，可能有助于支持有益的微生物群落，從而增強這一瀕危物種的適應力。未來的研究應關注微生物群組成變化是否直接轉化為疾病易感性或整體適應性的改變，并將微生物群監測納入長期保護實踐。
