環境DNA（eDNA）作為一種研究水生環境中魚類動態的強大工具有巨大潛力，但其在海洋系統中的定量能力，由于缺乏比較研究而備受爭議。本研究在法羅群島周圍的底層漁場，對標準化底拖網調查與環境DNA宏條形碼技術（12S）進行了比較。數據采集自六個區域的26個站點。拖網共檢測到31種魚類。納入分子操作分類單元（MOTUs）使調查類群豐富度增加了151%，達到47個，其中21種為兩種方法共同檢出，11種僅在拖網中檢出，15種僅在eDNA中檢出。拖網獨有檢出與低生物量物種（稀有性）和物種鑒別的技術限制（如平鲉屬 Sebastesspp.）相關。eDNA獨有檢出則與稀有性、體型、網具-行為特征以及中上層物種相關。對于兩種方法均檢出的類群，總reads數與整個調查區域的拖網生物量呈正相關（r=0.85, q<0.001），但在單個站點或區域尺度上則不顯著。考慮技術重復中的隨機擴增因素后，全調查尺度的eDNA-生物量相關性得到改善（r=0.91, q<0.001）。玉筋魚eDNA的區域分布與大西洋鱈的胃含物分析結果一致，這為拖網調查所遺漏的玉筋魚空間分布提供了信息。總體而言，eDNA宏條形碼技術識別出了拖網裝備采樣不足的小型物種，從而在方法結合時提高了物種豐富度。該研究還強調了eDNA在描述法羅群島海洋生態系統關鍵種（玉筋魚）空間分布方面的潛力，并生成了可靠的物種生物量等級估算。然而，研究也指出了eDNA和拖網在海洋系統中均存在的局限性：（i）低生物量物種的檢測；（ii）小空間尺度上的變異性；以及eDNA特有的局限性：（iii）來自中上層和底層棲息地的eDNA信號的垂直混合。

海洋漁業資源的可持續管理是一項重大挑戰。拖網調查是評估魚類種群的標準化技術。然而，商業漁業中高強度底拖網對底棲生態系統的有害影響已被廣泛認知數十年，估計每次拖網可清除6%–41%的動物生物量。此外，拖網調查的成本和裝備要求必須與其提供的高水平細節以及可執行的時空分辨率相權衡。盡管如此，人們已投入大量努力確保傳統采樣能夠提供可靠的豐度定量估計。隊列追蹤、年齡、大小和階段評估模型可用于估計可捕系數，提高調查結果的可解釋性。

相比之下，依賴水樣的非破壞性采集的環境DNA（eDNA）技術，已成為一種潛在強大且經濟高效的海洋魚類種群評估方法，能夠補充現有調查工作。利用水樣eDNA研究海洋魚類種群動態具有顯著優勢。水樣可從現有的標準海洋學調查、小型船只、自主水下航行器和系泊設備中采集，便于評估困難、敏感或生態重要的環境。eDNA技術的應用還通過公民科學項目、被動采樣方法、自然生物采樣器、自主采樣、原位分析和利用存檔樣本庫中的遺留數據得以擴展。

近年來發表了大量綜述文章，專門探討eDNA在水生環境中識別或量化特定魚類類群的應用。這些文章得出的結論較為一致。首先，eDNA與傳統調查方法結合使用，提高了對整體魚類多樣性的估計。傳統方法通常低估豐富度，因為群落成員對特定采樣網具表現出不同的行為或生物學特征，這體現在不同物種、個體發育階段和局地環境之間的可捕系數存在差異。其次，目前仍缺乏足夠的研究來明確比較eDNA與生物量/豐度指標，以了解eDNA提供魚類種群定量評估的潛力，特別是在海洋環境中。

由于研究匱乏，宏條形碼技術基于eDNA數據描述多種海洋魚類主要生物量分布，從而為漁業管理政策做出貢獻的能力仍在積極討論中。在此背景下，需要考慮兩個嵌套約束：（i）環境eDNA分子庫（“分子足跡”）在多大程度上反映了原位魚類群落；（ii）不同分析方法定量或半定量表示環境eDNA庫的能力（技術檢測偏差）。“分子足跡”的真實性受一系列復雜因素影響。技術檢測偏差則可能由引物特異性、PCR擴增效率、隨機性、參考數據庫覆蓋度和生物信息學嚴格性等因素引起。這些因素共同作用，理論上混淆了魚類生物量與eDNA拷貝數之間的穩健定量關系。

盡管如此，越來越多的文獻支持在海洋系統中eDNA與魚類生物量/豐度估計之間存在可重復的定量關系。然而，迄今為止在海洋系統中進行的許多eDNA-拖網研究是基于物種特異性qPCR方法。隨后又有少數研究對海洋和河口-沿海環境中eDNA宏條形碼與底拖網數據進行了多物種定量比較。這些研究普遍顯示出序列相對reads與生物量之間存在強度不一的積極關系。

為了進一步理解eDNA在提供海洋魚類群落時空分布的多物種信息方面的潛力，需要進行更多的海洋系統研究，專門探討宏條形碼與拖網捕獲量之間的定量關系。在此背景下，需要權衡拖網技術的已知缺點與eDNA的潛在局限性。本研究比較了法羅群島周圍標準化底拖網調查的eDNA宏條形碼數據與拖網捕獲數據，旨在實現以下目標：（i）比較eDNA與標準化拖網對魚類物種的檢測；（ii）識別eDNA和拖網獨有的檢測結果；（iii）在不同空間尺度上檢驗序列reads與拖網生物量之間的多物種相關性。

在FAMRI研究調查船Magnus Heinason號上進行春季底拖網調查期間（2018年2月至3月），采集了魚類捕獲物和配對的環境DNA（eDNA）水樣。在為期5周、面積約10萬平方公里、深度范圍約90-500米的調查區域內，共進行了26次配對的eDNA-拖網調查。底拖網在白天進行，持續1小時，船速3-3.5節，使用網目尺寸為135毫米的116英尺箱式拖網。上綱位于海底上方4.5-5米處。漁獲物鑒定到種水平，稱重，并標準化為單位努力漁獲量（CPUE）。

對于eDNA，使用安裝在CTD不銹鋼框架上的5升尼斯金瓶采集了1.5升海水樣本。樣本采集的目標深度對應于拖網高度5米，但由于船只運動和天氣條件，實際范圍在海底以上1.4至8.7米之間。采樣在拖網前進行，以避免無意中采集受擾動的沉積物，并最大限度地減少船只污染。

船上采取了細致措施以最大限度地減少潛在的污染源。簡而言之，CTD和尼斯金瓶用淡水徹底沖洗，并安裝在遠離拖網甲板的實驗室內。在分樣前，用20%體積/體積的漂白劑沖洗尼斯金瓶和噴嘴，并用超純水沖洗。海水被分樣到預先清洗過的2升低密度聚乙烯瓶中，放入凈化過的板條箱內的雙層塑料袋中儲存。每個樣品瓶沖洗三次，裝滿1.5升，立即蓋緊，放入雙層塑料袋中，儲存在船上的-20°C冷凍柜中。過濾在岸上進行以盡量減少污染。

當存在大西洋鱈時，對其胃進行取樣，12小時內解剖，對獵物進行分類、鑒定和稱重。未消化的標本被排除在外，以消除與在拖網中攝食相關的潛在人為影響。

返回無菌實驗室后，樣品儲存在與分子實驗室工作空間隔離的設施的-20°C冰箱中。樣品在單獨的濕實驗室中處理。樣品在室溫下解凍，外部用自來水、漂白劑和超純水清洗。樣品通過搖動2分鐘進行均質化，并使用蠕動泵以40轉/分鐘的轉速過濾到0.2微米的Sterivex濾膜上。Sterivex濾芯中殘留的樣本體積用一次性無菌50毫升魯爾鎖注射器推出并封蓋。Sterivex濾膜儲存在單獨的50毫升離心管中，置于-80°C。操作現場空白樣以相同方式處理。泵管在樣品間用漂白劑和超純水沖洗。

使用改良的Qiagen DNeasy血液和組織試劑盒方案從Sterivex濾芯中提取DNA。所有工作空間和儀器在使用前都用乙醇和RNase清除劑凈化。將Sterivex濾膜在室溫下解凍，并將其陽螺紋端火焰密封。提取過程按照制造商的說明進行，但有以下修改：將720微升ATL緩沖液和80微升蛋白酶K直接添加到濾芯內部，在旋轉振蕩器中于56°C孵育2小時。裂解液用1毫升無菌注射器回收，渦旋并離心。隨后，將600微升裂解液與等體積的AL緩沖液和乙醇混合，渦旋，離心，并以3×600微升等分試樣上樣到Qiagen離心柱上。DNA用120微升無核酸酶水洗脫兩次，并儲存在-80°C。DNA濃度用Qubit熒光計測量，范圍從0.16到2.3納克/微升。

操作現場空白樣在巡航的兩個不同日期采集，通過用超純水裝滿樣品瓶來模擬從CTD瓶中采樣。此外，在兩個不同的日子里，一個樣品瓶從罐中裝滿1.5升超純水，并在濕實驗室中暴露于船艙空氣中24小時。提取空白使用干凈的Sterivex濾膜按上述方法進行。在PCR板設置中包含一個PCR空白，其中模板DNA被替換為無RNase水。

為了擴增eDNA中感興趣的宏條形碼標記，采用了多重測序策略，即在PCR擴增步驟中對樣品進行標記，然后在測序前合并進行后續制備。每個樣品使用標記引物進行四次技術性PCR重復。使用標記的12S Mifish U引物擴增用于魚類生物多樣性研究的12S標記物。每個PCR反應體系為20微升，包含3微升eDNA模板。在Illumina MiSeq二代測序儀上使用v2化學試劑進行雙端測序。

測序后，使用OBITools軟件套件進行生物信息學分析的初始步驟。首先，使用 illuminapairedend合并雙端reads并進行質量過濾。使用 ngsfilter對樣品進行解復用，同時去除引物和標簽序列。然后進行長度過濾步驟 obigrep，隨后使用 obiuniq對reads進行去重復。使用vsearch中的 uchime-denovo算法去除嵌合體錯誤。使用SWARM 2.0將序列聚類為分子操作分類單元（MOTUs）。每個MOTU的代表序列通過 ecotag算法使用本地12S MiFish片段數據庫進行物種分類學分配。分配給細菌或生命之樹根、非脊椎動物物種、陸源污染的序列，以及在對照（空白）樣品中存在超過其總reads豐度10%的MOTUs均被去除。

為了解釋與單個水樣技術重復相關的PCR擴增變異性（隨機性）對后續統計分析的影響，我們采用了一種加權方法，根據reads在技術重復間的分布均勻性來縮放每個MOTU的平均reads數。

跨技術PCR重復的擴增均勻性通過Pielou均勻度指數進行量化。在計算S'之前，根據公式對每個技術重復的MOTU豐度進行歸一化。隨后計算每個MOTU的等效香農指數。計算S'后，根據公式，根據技術重復的一致性對平均MOTU reads進行加權。

使用相關性分析評估eDNA宏條形碼reads與拖網生物量之間的統計關聯。除了使用排名表示數據時使用Spearman相關系數外，其他情況均使用Pearson積矩相關系數。應用Benjamini–Hochberg校正對顯著性值進行多重比較校正，并相應報告為q值。

使用McNemar檢驗來評估零假設。檢測效應基于對eDNA和拖網方法性能的先驗預期，包括：（i）體型（長度）、（ii）棲息地偏好（底層/底層-中層、中層）、（iii）稀有性（站點占用率）、（iv）生物量（拖網）。連續變量的分類界限在補充表S1中給出。“小型”類群定義為那些小于拖網網目尺寸2倍的類群。稀有性基于組合站點占用率定義（如果任一方法檢測到則視為存在），定義為少于10%的站點。

經過過濾和質量控制的數據集包含1,897,283條reads，分布在109,919個人工序列變體中。使用SWARM2.0聚類后，共生成355個分子操作分類單元，過濾和質量控制步驟進一步將reads數減少到1,887,811條。經過 ecotag算法分類學分配后，MOTUs數量濃縮至總共41個。在整個調查區域最終共記錄了1,838,836條reads。分配給每個MOTU的reads數跨越四個數量級。物種在站點中記錄的比例范圍從0.04到0.96，而在區域中檢測到的物種比例范圍從0.17到1。總reads數與物種在eDNA樣本中被檢測到的站點比例和區域比例均呈強正相關。調查區域分為6個不同區域，共采樣26個站點。每個區域的reads數從東深區的160,428條到淺灘區的512,996條不等。操作樣品空白幾乎完全沒有來自樣本中鑒定的MOTUs的任何reads，唯一的例外是其中一個空白含有2,971條圓鰭魚（Cyclopterus lumpus）的reads。同樣，24小時空氣空白對大多數MOTUs呈陰性，盡管它們含有一些在拖網中捕獲的最豐富物種的reads。提取和PCR空白對所有MOTUs均為陰性。

在底拖網調查中，26個站點共捕獲了37,060公斤的總魚類生物量。單位努力漁獲量存在顯著的區域變異性。拖網樣本中共鑒定出31種魚類。就生物量而言，最豐富的兩種魚類是大西洋鱈和黑線鱈，它們是僅有的總生物量超過10,000公斤的兩個物種。玉筋魚是拖網數據中代表性最差的物種，總生物量僅為1.1公斤。

最終的eDNA數據集包含總共35個MOTUs，其中29個在物種水平上得以鑒定。12S序列在每個站點檢測到的MOTUs數量從南陸架的13個到北區的22個不等。從底拖網調查中分類出42個類群，其中31個被鑒定為魚類類群。每個區域鑒定的不同魚類類群數量從北區的8個到東深區的19個不等。共有類群定義為從拖網和eDNA調查中均鑒定出的類群。共有類群的數量從北區、南區、東陸架區和淺灘區的7個到西區的10個不等。結合eDNA和拖網檢測，總共得到47個類群；其中21個為共有，15個為eDNA獨有，11個為拖網獨有。

在拖網數據中獨特鑒定的14種魚類中，有三種是不同的平鲉屬物種，它們在eDNA 12S reads中僅被分類到屬水平。其余11個拖網獨有類群中，有8個的特點是總生物量低（<12公斤）且在調查區域內站點檢測率低。安康魚在八個拖網站點被檢測到，但調查生物量仍然相對較低。eDNA樣本獨有的魚類類群其reads豐度與共有物種處于相似的數量級，盡管它們通常也具有較低的站點檢測率。具有較高reads豐度和較高站點檢測率的獨特eDNA檢出對應于小型類群，以及中上層物種的罕見檢測。

基于先驗預期（中上層物種、體型、稀有性和拖網生物量）檢驗了拖網和eDNA方法在類群檢測方面的差異統計學證據。對于中上層物種，eDNA獨有的檢出數超過了拖網獨有的檢出數。對于底層和深海中層類群，未檢測到方法差異的證據。關于體型，在小型類群中，eDNA獨有的檢出數也顯著多于拖網獨有的檢出數。在非小型類群中，未發現方法差異的證據。對于稀有類群，eDNA獨有的檢出數同樣顯著多于拖網獨有的檢出數。在常見類群中，未發現方法差異的證據。在僅存在于拖網數據中的類群中，檢測到低生物量類群與拖網獨有檢出（相對于共有檢出）之間存在關聯。具體而言，在低生物量類群中，拖網獨有檢出的可能性是共有檢出的九倍。