本研究探討了微量元素鉬（Molybdenum， Mo）在兒童神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵期對(duì)基因調(diào)控的潛在影響。研究依托“環(huán)境暴露與兒童健康結(jié)局”（Environmental Exposures and Child Health Outcomes， EECHO）隊(duì)列，該隊(duì)列涵蓋了美國紐約州雪城低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位社區(qū)的9至11歲歐裔美國（European American， EA）和非裔美國（African American， AA）兒童。此年齡段兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育迅速，對(duì)環(huán)境壓力源（如有毒物質(zhì)和膳食因素）高度敏感。

鉬在人體生物學(xué)中主要以鉬輔因子（Molybdenum cofactor， MoCo）形式存在，是亞硫酸鹽氧化酶、黃嘌呤氧化還原酶和醛氧化酶等多種酶的關(guān)鍵成分。這些MoCo依賴酶參與硫氨基酸代謝和嘌呤分解代謝等核心代謝途徑，這些途徑與一碳代謝相交織。一碳代謝為DNA甲基化（DNA methylation， DNAm）反應(yīng)提供甲基供體，如S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine， SAM）。此外，MoCo生物合成本身也與一碳代謝相連：該途徑中的關(guān)鍵酶MOCS1A屬于自由基SAM超家族，需要SAM作為其催化活性的底物。因此，消耗SAM的條件不僅可能損害DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，也可能限制MoCo的合成效率。這些相互關(guān)聯(lián)的途徑為鉬相關(guān)代謝與DNA甲基化模式改變之間提供了生物學(xué)上合理的聯(lián)系。臨床相關(guān)性在于，遺傳性MoCo缺乏會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，而產(chǎn)前暴露于高水平鉬則會(huì)損害心理運(yùn)動(dòng)發(fā)育。

DNA甲基化對(duì)神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要，并受飲食和壓力等因素影響。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor， BDNF）是一種對(duì)神經(jīng)元存活和發(fā)育至關(guān)重要的蛋白質(zhì)（即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）。BDNF調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)活性，并支持學(xué)習(xí)和記憶所需的神經(jīng)可塑性。當(dāng)非編碼的BDNF基因鏈（BDNF反義轉(zhuǎn)錄本， BDNF-AS）上調(diào)時(shí)，BDNF水平會(huì)下降。這種表觀遺傳控制與自閉癥譜系障礙、帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。相反，沉默BDNF-AS可改善神經(jīng)突生長(zhǎng)，減少活性氧物種和炎癥，具有神經(jīng)保護(hù)作用。抑郁癥、精神分裂癥、雙相情感障礙和自閉癥都與早期生活逆境、DNA甲基化改變和BDNF表達(dá)有關(guān)。

人類主要通過谷物、牛奶、乳制品、豆類和堅(jiān)果獲取鉬。尿鉬是近期膳食攝入的敏感且無創(chuàng)的標(biāo)志物，在受控環(huán)境中，高達(dá)60%的攝入量可能通過尿液排出。由于尿排泄與膳食攝入相關(guān)，監(jiān)測(cè)自由生活人群的鉬狀態(tài)相對(duì)簡(jiǎn)單，典型的排泄范圍為43.5-90.4 μg/g肌酐/天，反映了近期的膳食消耗。為了探索鉬的表觀遺傳影響，本研究考察了膳食攝入、尿鉬排泄、BDNF DNA甲基化、皮質(zhì)醇水平和認(rèn)知之間的關(guān)聯(lián)。我們的研究代表了首個(gè)已知證據(jù)，表明鉬可能在兒童BDNF的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用。

生物樣本和相關(guān)數(shù)據(jù)來自紐約雪城雪城大學(xué)的EECHO隊(duì)列，這是一項(xiàng)檢查兒童環(huán)境毒物暴露和亞臨床心血管疾病的橫斷面研究。全年招募從2013年8月1日持續(xù)到2017年11月30日。所有程序均獲得雪城大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。DNA甲基化分析聚焦于從292名有效尿液樣本捐贈(zèng)者中隨機(jī)按種族和性別選擇的72名兒童。

DNA提取由紐約州立大學(xué)上州醫(yī)科大學(xué)精神病學(xué)遺傳流行病學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。DNA純化和全基因組甲基化分析由Diagenode Epigenomic Services LLC完成，使用覆蓋約850，000個(gè)CpG位點(diǎn)的Infinium Methylation EPIC芯片。

紐約州衛(wèi)生部沃茲沃斯中心無機(jī)與核化學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用經(jīng)過充分驗(yàn)證的基于電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）的方法分析尿液樣本中的一系列微量元素，包括鉬。尿鉬值經(jīng)肌酐校正并以μg/g報(bào)告。

使用Salimetrics皮質(zhì)醇酶免疫測(cè)定試劑盒測(cè)量唾液皮質(zhì)醇濃度（Salivary cortisol concentration， SCC， μg/dL）。我們測(cè)量了唾液皮質(zhì)醇的晝夜斜率以及平均晝夜皮質(zhì)醇。

使用自動(dòng)化自我管理24小時(shí)（Automated Self-Administered 24 h， ASA24）膳食評(píng)估工具收集兩天的兒童飲食數(shù)據(jù)。通過將食物分類并計(jì)算代表性食物的鉬含量（μg/g）來估算平均鉬攝入量（微克）。

使用考夫曼簡(jiǎn)明智力測(cè)驗(yàn)第二版（Kaufman Brief Intelligence Test， KBIT）測(cè)量?jī)和�認(rèn)知功能（Child cognitive functioning， CCF）。

由于資金限制，DNA甲基化分析僅限于292名參與者中具有完整飲食和DNA甲基化數(shù)據(jù)的72名。為了克服樣本量小的限制，我們采用了靶向基因方法，專注于BDNF基因及其反義轉(zhuǎn)錄本（BDNF-AS）中的107個(gè)CpG位點(diǎn)。數(shù)據(jù)使用R/Bioconductor中^minfi包中的ssNoob進(jìn)行預(yù)處理和歸一化。

使用R/Bioconductor中的EpiDISH包通過穩(wěn)健偏相關(guān)估計(jì)細(xì)胞異質(zhì)性。從DNA甲基化數(shù)據(jù)生成了祖先主成分（mPC2和mPC3）以解釋DNA甲基化變異的遺傳驅(qū)動(dòng)因素。從EPIC注釋文件中選擇了BDNF和BDNF-AS基因，產(chǎn)生了107個(gè)CpG位點(diǎn)用于分析。

使用線性回歸模型測(cè)試尿鉬（自變量，經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以減少正偏態(tài)）與單個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化（因變量）之間的關(guān)聯(lián)。模型控制了種族、性別、細(xì)胞類型比例（CD8⁺T、CD4⁺T、NK、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）和遺傳主成分（mPC2， mPC3）。應(yīng)用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate， FDR）方法對(duì)所有測(cè)試的107個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行多重比較校正，F(xiàn)DR校正后的^p值<.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)于皮質(zhì)醇-甲基化關(guān)聯(lián)，使用帶有交互項(xiàng)和Satterthwaite校正的線性回歸進(jìn)行按種族的調(diào)節(jié)分析。

我們的樣本包括45.8%的AA兒童（ⁿ= 33）和54.2%的EA兒童（ⁿ= 39），性別分布為48.6%女性（ⁿ= 35）。參與者平均年齡為10.61歲（SD = 0.94）。平均收入水平為6.61（SD = 2.92），對(duì)應(yīng)于20，000-25，000美元的家庭收入范圍。父母平均報(bào)告受過一些大學(xué)教育（M = 4.84， SD = 1.46），平均職業(yè)得分較低（M = 3.35， SD = 2.88），確認(rèn)參與者屬于中低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位。

平均每日膳食鉬攝入量為134.38 μg（SD = 45.03），與美國人群120–240 μg的范圍一致。AA和EA兒童之間的鉬攝入量無顯著差異。大部分（81.7%）鉬攝入來自谷物（22.8%）、牛奶和乳制品（21.4%）、混合菜肴（17.8%）、蛋白質(zhì)（10.2%）以及甜食/零食（9.6%）。

尿鉬排泄量（81.08 μg/g肌酐， SD = 46.14）與預(yù)測(cè)的排泄量76.9 μg（SD = 30.0）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，驗(yàn)證了手動(dòng)鉬估算。經(jīng)肌酐校正的鉬水平反映了膳食攝入（M = 81.0 μg/g， SD = 46.6； r(70) = .24， p = .044）。AA兒童的鉬排泄量（M = 68.25 μg/g肌酐， SD = 35.12）低于EA兒童（M = 91.76 μg/g肌酐， SD = 52.43）。11名兒童的尿鉬水平至少比平均值高一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，達(dá)到此閾值的男孩（ⁿ= 9）多于女孩。此外，六名兒童超過平均值兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。

在控制協(xié)變量和肌酐后，鉬與BDNF和BDNF-AS上的六個(gè)CpG位點(diǎn)的DNA甲基化存在FDR顯著關(guān)聯(lián)。較高的鉬水平與位于BDNF-AS體內(nèi)的cg04685076位點(diǎn)的DNA甲基化增加相關(guān)（^t= 4.088， ^p= .0001， ^R2= 0.411）。

相反，鉬與BDNF基因5'非翻譯區(qū)（5' untranslated region， 5'UTR）內(nèi)五個(gè)CpG位點(diǎn)的DNA甲基化降低相關(guān)：cg06046431（^t= -3.735， ^p= .0003， ^R2= 0.251）、cg27193031（^t= -3.386， ^p= .001， ^R2= 0.211）、cg18117895（^t= -3.269， ^p= .001， ^R2= 0.237）、cg25381667（^t= -3.236， ^p= .001， ^R2= 0.214）和cg15688670（^t= -3.123， ^p= .002， ^R2= 0.270）。

在先前的研究中，BDNF 5'UTR區(qū)域的DNA甲基化減少與基因轉(zhuǎn)錄增加相關(guān)，表明鉬可能影響B(tài)DNF表達(dá)。此外，BDNF-AS的DNA甲基化增加可能進(jìn)一步促進(jìn)BDNF轉(zhuǎn)錄，考慮到BDNF和BDNF-AS之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)表明，鉬可能通過表觀遺傳機(jī)制在BDNF表達(dá)上調(diào)中發(fā)揮作用。

在控制社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位、種族、性別、細(xì)胞類型和多重比較后，BDNF DNA甲基化與兒童認(rèn)知功能無顯著關(guān)聯(lián)，唾液皮質(zhì)醇濃度與BDNF DNA甲基化也無顯著關(guān)聯(lián)。然而，調(diào)節(jié)分析揭示了種族特異性的交互作用：在AA兒童中，BDNF DNA甲基化在cg23497217位點(diǎn)隨著唾液皮質(zhì)醇濃度水平升高而增加（^R2= 0.228， β = 0.524， ^t= 3.198， ^p= .003），而在EA兒童中未觀察到顯著關(guān)系（^R2= 0.072， β = -0.233， ^t= -1.604， ^p= .117）。

鉬在人體生物學(xué)中僅作為輔因子MoCo發(fā)揮作用，是幾種酶正常功能所必需的。雖然這些Mo依賴酶不直接參與一碳代謝，但MoCo生物合成本身與該途徑相交。值得注意的是，MoCo生物合成中的關(guān)鍵酶MOCS1A屬于自由基SAM超家族，需要SAM作為其催化活性的底物。由于SAM也是DNA甲基化的通用甲基供體，這創(chuàng)造了一種潛在的雙向關(guān)系。SAM耗竭可能同時(shí)損害DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和MoCo生物合成。此外，由于MoCo依賴酶參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)，并且有強(qiáng)有力證據(jù)表明氧化應(yīng)激可以增加BDNF甲基化，鉬狀態(tài)的改變可能通過氧化途徑影響DNA甲基化。這些相互關(guān)聯(lián)的途徑為理解鉬水平如何影響DNA甲基化模式提供了一個(gè)假設(shè)但生物學(xué)上合理的框架。

盡管尚未建立MoCo依賴酶活性與DNA甲基化之間的直接機(jī)制，但我們觀察到的尿鉬排泄與BDNF甲基化模式之間的關(guān)聯(lián)與這些提出的間接途徑一致。通過MoCo依賴途徑的鉬失調(diào)的臨床相關(guān)性已得到充分證明：遺傳性MoCo缺乏會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，而過度的產(chǎn)前鉬暴露會(huì)損害神經(jīng)發(fā)育結(jié)果。考慮到所涉及的復(fù)雜相互作用以及對(duì)鉬對(duì)DNA甲基化和基因表達(dá)影響的有限理解，我們的研究具有重要意義，因?yàn)樗�提供了將鉬狀態(tài)與BDNF位點(diǎn)的表觀遺傳調(diào)控聯(lián)系起來的第一觀察證據(jù)，該基因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。

我們研究人群的平均每日鉬攝入量在美國普通人群報(bào)告的范圍內(nèi)。與先前研究一致，近25%的膳食鉬來自谷物和谷物制品，而牛奶和乳制品貢獻(xiàn)了另外20%，占總熱量攝入的很大一部分。盡管AA和EA兒童之間的鉬攝入量沒有顯著差異，但AA兒童的鉬排泄量顯著較低，表明生物保留率較高。這可能反映了群體之間MoCo依賴酶活性或代謝需求的差異。值得注意的是，我們還觀察到皮質(zhì)醇與BDNF甲基化之間關(guān)系的種族特異性差異，表明多種因素可能導(dǎo)致該人群應(yīng)激反應(yīng)和表觀遺傳調(diào)控的種族差異。

鉬排泄迅速，全身半衰期約為1-2周。僅通過飲食很少達(dá)到毒性水平。在我們的研究中，11名兒童的尿鉬水平至少比平均值高一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，六名超過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。然而，沒有參與者超過毒性閾值（1，100 μg/天）。盡管如此，該隊(duì)列的平均攝入量是9-13歲兒童推薦每日攝入量（34 μg/天）的5.3倍。我們的研究無法解釋尿鉬水平升高的兒童潛在的環(huán)境鉬暴露，這可能解釋了一些兒童觀察到的尿鉬水平升高。鉬通過汽油發(fā)動(dòng)機(jī)燃燒、焚化爐和火葬場(chǎng)釋放到環(huán)境中，但研究區(qū)域沒有設(shè)施報(bào)告鉬空氣排放或廢物釋放。未來的研究應(yīng)檢查膳食和環(huán)境鉬來源，以更好地了解它們對(duì)神經(jīng)發(fā)育和表觀遺傳調(diào)控的影響。

我們的研究聚焦于低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位兒童，這是一個(gè)面臨糧食不安全、認(rèn)知差異和前額葉皮層功能障礙風(fēng)險(xiǎn)的人群。盡管我們沒有發(fā)現(xiàn)鉬對(duì)兒童認(rèn)知功能的直接影響，但觀察到的與尿鉬排泄增加相關(guān)的BDNF甲基化變化表明，鉬可能影響對(duì)神經(jīng)元可塑性至關(guān)重要的BDNF的調(diào)控。這是重要的，因?yàn)橄惹暗墓ぷ鞅砻鳎珼NA甲基化介導(dǎo)的BDNF表達(dá)調(diào)控影響神經(jīng)元發(fā)育、可塑性和對(duì)壓力的適應(yīng)。BDNF表達(dá)改變也與壓力相關(guān)的精神障礙有關(guān)，突出了其作為神經(jīng)和精神疾病新療法靶點(diǎn)的潛力。

飲食模式，如食物限制、高脂肪飲食、禁食和時(shí)間限制喂養(yǎng)，都被發(fā)現(xiàn)通過DNA甲基化表觀遺傳地調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)。此外，許多維生素，包括葉酸、B₁₂、B₆、膽堿和蛋氨酸，在甲基化途徑中起關(guān)鍵作用。雖然其他必需礦物質(zhì)已被證明可以調(diào)節(jié)表觀遺傳過程，但在此研究之前，沒有支持性證據(jù)表明鉬可能發(fā)揮類似作用。

我們強(qiáng)調(diào)，我們的研究確定了鉬狀態(tài)與BDNF甲基化之間的關(guān)聯(lián)，而非因果或直接的酶促機(jī)制。鉬對(duì)DNA甲基化的任何影響都必然通過MoCo依賴的酶促途徑發(fā)生，盡管具體機(jī)制仍有待闡明。盡管如此，我們的發(fā)現(xiàn)仍然有助于越來越多的證據(jù)表明，早期生命營(yíng)養(yǎng)因素，包括必需礦物質(zhì)攝入，會(huì)影響DNA甲基化和基因表達(dá)，并對(duì)神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生潛在的長(zhǎng)期影響。

我們觀察到的甲基化變化方向（即BDNF 5'UTR位點(diǎn)甲基化降低和BDNF-AS甲基化增加）都與BDNF轉(zhuǎn)錄活性增加一致。然而，我們沒有在本研究中測(cè)量BDNF蛋白水平或mRNA表達(dá)，這限制了我們確認(rèn)這些表觀遺傳變化的功能后果的能力。此外，雖然我們探索了鉬、BDNF甲基化和應(yīng)激生物標(biāo)志物之間的潛在關(guān)系，但我們沒有發(fā)現(xiàn)鉬水平與皮質(zhì)醇之間的直接關(guān)聯(lián)，表明這些是影響該人群BDNF調(diào)控的獨(dú)立因素。

雖然我們的研究發(fā)現(xiàn)鉬與BDNF甲基化模式之間存在關(guān)聯(lián)，但我們沒有觀察到鉬與皮質(zhì)醇水平之間的直接關(guān)系。然而，我們探討了BDNF甲基化本身（無論鉬狀態(tài)如何）是否與皮質(zhì)醇調(diào)節(jié)有關(guān)，因?yàn)锽DNF在應(yīng)激反應(yīng)途徑中起關(guān)鍵作用。我們之前曾注意到我們研究隊(duì)列中AA兒童的唾液皮質(zhì)醇濃度升高，這是低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位兒童常見的應(yīng)激生物標(biāo)志物。我們的研究結(jié)果表明，升高的皮質(zhì)醇水平也可能不成比例地影響AA兒童中BDNF基因的表觀遺傳沉默，對(duì)抑郁和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的易感性具有潛在影響，使其成為進(jìn)一步研究的重要領(lǐng)域。

這項(xiàng)研究首次證明兒童尿鉬排泄與BDNF和BDNF-AS基因內(nèi)特定CpG位點(diǎn)的DNA甲基化模式改變之間存在關(guān)聯(lián)。較高的鉬水平與BDNF 5'UTR區(qū)域五個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化降低以及BDNF-AS基因體內(nèi)一個(gè)位點(diǎn)的甲基化增加相關(guān)。由于BDNF 5'UTR區(qū)域的甲基化減少和BDNF-AS甲基化增加都與BDNF蛋白表達(dá)增加相關(guān)，這些模式表明鉬狀態(tài)可能在發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期影響B(tài)DNF基因調(diào)控。然而，需要進(jìn)行功能研究來確認(rèn)這些甲基化變化是否轉(zhuǎn)化為BDNF蛋白水平的改變和神經(jīng)發(fā)育結(jié)果。

除了早期發(fā)育，膳食鉬還通過其在β-淀粉樣肽抑制和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中的作用，與阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。考慮到營(yíng)養(yǎng)在DNA甲基化模式、“表觀遺傳記憶”和壓力下神經(jīng)保護(hù)中的更廣泛作用，我們的研究結(jié)果表明，充足的鉬攝入可能支持大腦健康，尤其是在生命早期。

谷物和乳制品是鉬的關(guān)鍵膳食來源，可能在支持社會(huì)經(jīng)濟(jì)弱勢(shì)人群的神經(jīng)發(fā)育方面發(fā)揮保護(hù)作用。這些人群通常面臨更大的環(huán)境壓力源暴露，如污染、糧食不安全、槍支暴力和不良童年經(jīng)歷，所有這些都可能對(duì)認(rèn)知功能和神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，這些因素與智商差異和前額葉皮層功能障礙有關(guān)，這可能損害自上而下的處理和情緒調(diào)節(jié)。因此，加強(qiáng)糧食安全和獲得富含鉬的食物可能對(duì)中低社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位兒童的神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生顯著益處。

雖然膳食鉬對(duì)BDNF表達(dá)和神經(jīng)發(fā)生似乎是必需的，但也應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)過度的環(huán)境暴露。與錳類似，錳調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)，但過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)和行為障礙，如果暴露超過生理需求，鉬也可能產(chǎn)生有害影響。鑒于某些城市地區(qū)存在鉬過度暴露的證據(jù)，未來的研究應(yīng)探索環(huán)境鉬暴露的潛在風(fēng)險(xiǎn)及其對(duì)基因調(diào)控和神經(jīng)健康的長(zhǎng)期影響。我們的發(fā)現(xiàn)突出了鉬排泄、基因表達(dá)和種族之間復(fù)雜的相互作用，強(qiáng)調(diào)了需要進(jìn)一步研究以闡明鉬在健康和疾病中的作用。

本研究的局限性包括橫斷面設(shè)計(jì)，無法進(jìn)行因果推斷；缺乏BDNF蛋白或mRNA測(cè)量，限制了功能后果的解釋；以及無法區(qū)分鉬水平升高兒童的膳食和環(huán)境鉬來源。未來需要結(jié)合BDNF表達(dá)測(cè)量、MoCo酶活性測(cè)定和全面鉬暴露評(píng)估的縱向研究，以闡明這些關(guān)聯(lián)背后的機(jī)制及其對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響。