《Genes, Brain and Behavior》：Calorie Restriction Effects on Aging, Learning Performance, and Transcription in Aged Aplysia californica
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本研究通過對比自由取食（AL）與熱量限制（CR）飲食下的加州海兔（Aplysia californica），揭示了CR不僅延遲了由反射行為定義的生物衰老，還能在年老個體中維持特定的學習能力（如學習食物不可食，LFI）。研究結合行為學與轉錄組學分析發現，CR條件下的年老動物其學習表現與年輕個體相當，且學習行為（LFI）后神經元（特別是運動與中間神經元）中富集了與記憶鞏固相關的基因通路（如蛋白激酶C結合GO:0005080、鈣粘蛋白結合GO:0045296、微管切割ATP酶活性GO:0008568以及神經活性配體-受體相互作用ko04080等）。這些結果表明，CR可能通過調節神經元的結構與功能相關基因表達，延緩了大腦衰老相關的認知衰退，為理解營養干預延緩神經功能退行提供了新的視角。
文章內容歸納總結
1 引言
熱量限制（CR）已被證實是延長多種生物壽命最成功的實驗干預手段，從酵母、秀麗隱桿線蟲、果蠅到部分靈長類動物均有報道。伴隨壽命延長的，還有體脂減少、代謝率降低、氧化損傷減輕、自噬增強、炎癥減少等一系列生理效應。目前尚不清楚CR是啟動了促進延壽的生理效應，還是通過減緩生物衰老過程本身起作用。
生物衰老不同于時間年齡，它指的是個體衰弱和機能喪失的速率，可通過DNA甲基化等分子生物標志物或握力、步速等體能指標來衡量。在加州海兔（Aplysia californica）這種神經模型生物中，生物衰老可以通過已知年齡動物的反射行為（如翻正反射和尾部收縮反射）時間來測定。
與壽命延長相比，CR對學習能力的提升作用研究較少，但已有研究表明CR能提高老年嚙齒動物和部分人類試驗的學習表現，并伴隨著NMDA和AMPA離子型谷氨酸受體的增加、神經元損失的減輕、突觸效能增強以及與神經可塑性相關的基因（如腦源性神經營養因子BDNF、胰島素樣生長因子1等）表達增加。類似地，尚不清楚CR是促進了增強學習表現的生理變化，還是減緩了大腦衰老。
本研究旨在檢驗，在生物衰老被CR延遲的、年老的加州海兔與其年輕兄弟姐妹相比，認知表現是否得到提升。研究結果在年老CR海兔中未發現認知能力的增益或損失，表明認知能力在衰老過程中得到了維持，這與自由取食（AL）的老年海兔出現的多種認知變化跡象形成對比。基因表達結果在很大程度上支持了這一觀點。
2 材料與方法
2.1 動物飼養與反射行為
研究使用來自同一卵塊的同時雌雄同體加州海兔兄弟姐妹。在孵化后5個月，動物被分為四組飼養籠，其中兩組（200只）接受自由取食（AL）飼養，另外兩組（200只）接受熱量限制（CR）飼養，CR組的食物供應量為AL組的60%。兩周后，兩種飲食中都加入了10%的石莼屬藻類。在6個月大時，部分動物被轉移到模擬自然棲息地水流環境的“運動”飼養環境中。動物的生物年齡階段通過測量其完成翻正反射（TTR）和尾部收縮反射（TWR）的時間來確定，這些反射行為從9-11個月齡開始每月測量。
2.2 CR判定
動物進入“運動”飼養環境后，CR組的投喂量調整為每周每籠5只動物總重量的65%。AL組則持續供應食物。每周對動物稱重并計算CR組下周的投喂量。通過監測CR組的生長曲線、觀察是否有痛苦行為（如自發噴墨），以及對足部肌肉組織進行近似分析和脂肪酸譜分析，來確保CR的實施未導致營養不良。分析結果顯示，CR組與AL組肌肉組織成分差異微小，表明CR動物并未營養不良。
2.3 學習食物不可食（LFI）
動物在其生命周期的兩個時間點進行LFI訓練：訓練時間1（TT1，年齡7-9個月）和訓練時間2（TT2，年齡10個月）。LFI訓練時，將裝有石莼的網探針呈現給饑餓48小時的動物，記錄動物將探針含在口中的總時間（TTIM）。如果第一天TTIM > 100秒，則在禁食26小時后進行第二天的回憶測試。學習表現的衡量指標是第二天相比第一天節省時間的百分比（%SAV）。只有獲得正%SAV（+%SAV）的動物被認為成功建立了LFI的長期記憶（LTM），并用于后續的行為比較、TWR習慣化訓練和基因表達分析。負%SAV或第一天未達到標準的動物被排除。
2.4 尾部收縮反射（TWR）的習慣化
在完成LFI第二天測試后，對獲得+%SAV的動物進行TWR習慣化訓練。測量動物收縮前后的長度，以收縮長度占初始長度的比例作為TWR幅度。在習慣化訓練前后分別測量三次作為基線（前測）和測試（后測），習慣化訓練包括50次尾部輕觸。
2.5 統計分析
使用夏皮羅-威爾克檢驗數據正態性，隨后根據數據類型選擇克魯斯卡爾-瓦利斯檢驗、威爾科克森秩和檢驗、雙向方差分析、學生t檢驗或配對t檢驗等，并進行邦費羅尼多重檢驗校正。壽命差異使用卡普蘭-邁耶生存分析。
2.6 RNA測序
在LFI第二天回憶測試后2小時，處死獲得+%SAV的動物以及未訓練的對照動物（禁食76小時以匹配LFI測試動物的禁食時長），取其部分口神經節（包含許多參與LFI的中間神經元和運動神經元）進行RNA提取。使用Illumina NovaSeq 6000進行雙端測序。
2.7 主成分分析與差異基因表達分析
使用DESeq2進行主成分分析（PCA）和差異基因表達分析。構建的統計模型包含三個自變量：時間年齡（TT1或TT2）、LFI訓練狀態（未訓練U或訓練T）和飲食（AL或CR），并添加了代表所有因子水平完全交互作用的交互項。通過Wald檢驗識別差異表達基因（DEG），篩選條件為校正p值 < 0.05。共進行了六組比較。
2.8 層次聚類分析
對所有DEG進行正則化對數變換和縮放，然后使用pheatmap進行層次聚類分析，觀察樣本如何根據自變量聚類。
2.9 基因本體論與KEGG通路富集分析
使用clusterProfiler對六組比較的基因集進行基因集富集分析（GSEA），以識別顯著富集的基因本體論（GO）術語和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路。顯著性術語經過q值過濾（q > 0.80的術語被移除）。
2.10 差異轉錄本使用分析
使用DRIMSeq和stageR分析差異轉錄本使用（DTU），以推斷可能發生的亞型轉換或選擇性剪接事件。
3 結果
3.1 用于LFI的衰老階段劃分與反射行為
根據反射行為時間，AL動物在7個月大時（TT1開始時）已達到性成熟階段，并在10個月大時（TT2開始時）進入最衰老階段AII。而CR動物在TT2時仍處于性成熟階段，比AL動物年輕兩個衰老階段，這表明CR顯著延遲了行為衰老。這種延遲持續了約1個月。
3.2 生命與死亡
AL動物在實驗開始后的每周稱重中均顯著重于其CR兄弟姐妹。然而，CR并未顯著影響本研究中動物的壽命，最終一只CR動物比最后一只AL動物早16天死亡。
3.3 營養分析
足部肌肉組織的化學成分分析結果顯示，CR組與AL組之間差異微小，表明CR動物并未出現營養不良。
3.4 學習食物不可食（LFI）
在LFI學習中，AL動物在TT2的表現（%SAV）顯著優于TT1，部分TT2 AL動物甚至在第二天完全不嘗試攝取探針，實現了100%的節省率。而CR動物在TT1和TT2之間的%SAV沒有差異，表現穩定。TT1 CR動物在第一天表現出更多的攝取嘗試、更長的TTIM和總耗時，提示它們可能比AL動物更饑餓，但這種現象在TT2 CR動物中未出現。
3.5 尾部收縮反射（TWR）的習慣化
如預期，TT1 AL海兔能習慣化TWR，而TT2 AL海兔則不能。相比之下，所有在TT1和TT2測試的CR海兔都成功習慣化了其TWR，表明CR延緩了與TWR習慣化能力喪失相關的神經功能衰退。
3.6 基因表達結果
主成分分析（PCA）表明，時間年齡是導致口神經節樣本基因表達差異的最大驅動因素，解釋了27%的方差。飲食是另一個顯著但影響較小的驅動因素，解釋了3%的方差。LFI訓練狀態未顯示出顯著的全局基因表達差異。
差異基因表達分析結果顯示，各比較組中差異表達的基因數量不多。其中，年齡CR（TT2UCR vs. TT1UCR）動物顯示出最大的基因表達差異。值得注意的是，有七個基因在年輕的AL動物LFI訓練后下調，而在年輕的CR動物LFI訓練后上調，其中六個在年老的AL動物中也上調，表明飲食和年齡對這些基因的表達有交互影響。層次聚類分析支持PCA的結果，顯示樣本首先按時間年齡聚類，然后按飲食，最后按LFI狀態聚類。
基因集富集分析（GSEA）揭示了與年齡和LFI相關的功能變化。在年老的AL動物（Age AL）中，與神經元發育（如軸突發生GO:0007409、軸突導向GO:0007411）相關的GO術語被抑制，而與維持細胞極性（如雙極細胞極性建立或維持GO:0061245）和細胞粘附相關的GO術語被激活，這反映了年老神經元為維持功能所做的努力。這些變化在年老的CR動物（Age CR）中未顯著富集，表明CR可能延緩了這些與衰老相關的轉錄反應。
在年老的AL動物進行LFI訓練后（LFI aged AL），富集了與突觸重塑和記憶鞏固相關的GO術語，包括微管切割ATP酶活性（GO:0008568）、鈣粘蛋白結合（GO:0045296）和蛋白激酶C結合（GO:0005080）。這些術語未在單純的Age AL中富集，提示它們是由LFI學習行為特異性誘導的。此外，神經活性配體-受體相互作用（ko04080）和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成（ko00290）這兩個KEGG通路也在LFI aged AL中顯著富集并激活，后者與學習能力的提高有關。
差異轉錄本使用（DTU）分析發現，在Age AL動物中，復合蛋白（complexin）和原肌球蛋白-2（tropomyosin-2）存在顯著的亞型使用差異；在LFI aged AL動物中，septin-11存在顯著的亞型使用差異。這些基因分別與神經遞質釋放、肌動蛋白絲穩定/突觸受體運輸以及神經元細胞骨架/GABA能突觸相關。值得注意的是，在Age CR或LFI aged CR動物中未檢測到這些基因的顯著DTU，這可能與CR動物不同的學習表現模式有關。
4 討論
盡管本研究未觀察到CR延長加州海兔的壽命，但通過反射行為、兩種不同的學習測試以及基因表達結果均證實CR延遲了生物衰老。CR動物在年老時仍能習慣化TWR，且在LFI學習中表現穩定，沒有出現像AL動物那樣的年齡相關變化（AL動物在年老時TWR習慣化失敗，但LFI回憶能力反而增強）。這種不同行為模式的老化差異，可能源于控制尾部收縮和口器進食的神經回路以不同速率衰老，或者日常使用的進食回路因“用進廢退”而得到一定保護。
基因表達結果從分子層面支持了行為學發現。PCA和層次聚類均表明，時間年齡是基因表達最大的變異來源，飲食的影響較小但顯著，而LFI訓練本身并未引起全局性的基因表達變化。然而，通過GSEA進行的通路分析揭示了更細微的功能變化。年老的AL動物表現出與神經元發育抑制和細胞極性維持增強相關的轉錄特征，這可能是一種代償性努力，以對抗衰老相關的功能衰退。CR似乎延緩了這些轉錄反應的出現。
更重要的是，在年老的AL動物進行LFI學習后，其神經元中富集了與突觸結構重塑（微管切割、鈣粘蛋白結合）和信號傳導（蛋白激酶C結合）相關的通路，這可能是其LFI回憶能力增強的分子基礎。這些變化可能促進了突觸連接的修剪與重建，從而鞏固記憶。同時，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路的激活也與更高的學習能力相關。DTU分析進一步提示，在衰老和學習過程中，特定神經功能相關基因（如complexin、tropomyosin-2、septin-11）可能通過亞型轉換來調節其功能，而這些轉換在CR條件下并未發生，或模式不同。
綜上所述，本研究在無脊椎模型加州海兔中證明，熱量限制能夠延緩由行為和轉錄組定義的生物衰老進程，并在衰老過程中維持特定的認知功能（如反射習慣化）。其分子機制可能涉及對神經元發育、突觸可塑性以及氨基酸代謝等相關基因通路的調節。盡管CR對壽命的影響在本研究中不顯著，但其對“健康壽命”特別是神經功能維持的積極作用，為理解營養干預如何對抗年齡相關的認知衰退提供了有價值的見解。未來需要通過功能驗證實驗（如基因敲低或過表達）來進一步闡明這些轉錄變化在行為表現中的具體作用。
