豬圓環病毒（PCVs）是一種小型無包膜、二十面體結構的病毒，具有約2000個核苷酸（nt）的單鏈環狀DNA基因組，屬于Circovirus屬，Circoviridae科。迄今為止，根據發現順序，已在豬體內鑒定出四種PCV物種——PCV1 [2]、PCV2 [3, 4, 5, 6]、PCV3 [7, 8]，以及最近的PCV4 [9, 10, 11, 12, 13, 14]。PCV3最早于2016年由美國兩個獨立研究小組發現，分別與繁殖失敗、豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）、心臟炎癥及多器官炎癥相關 [7, 15]。后續研究表明，PCV3可以感染健康和患病的豬 [16, 17, 18]，并且可以在多種組織和體液中檢測到，包括大腦、腎臟、心臟、脾臟、血清、口腔和鼻腔分泌物、糞便、初乳和精液 [19]。系統發育分析表明，PCV3在進化上與其他PCVs不同，可能起源于蝙蝠圓環病毒，之后才適應了豬和其他動物宿主，這引發了關于跨物種傳播的擔憂 [19]。目前，基于實地調查和回顧性研究，在包括中國、巴西、韓國、日本、泰國和一些歐洲國家在內的地區都報道了PCV3的存在 [7, 20, 21, 22]。此外，在PCV3陽性豬心臟異種移植后，在狒狒受體中檢測到PCV3的復制，這突顯了潛在的人畜共患病風險，強調了需要可靠的診斷工具 [23]。因此，開發快速且高靈敏度的PCV3檢測技術對于有效診斷和監測至關重要。
RAA是一種等溫核酸擴增技術，源自重組酶聚合酶擴增（RPA）。RAA的引物-探針配置和作用機制與RPA相同，不同之處在于RPA中使用的是噬菌體T4 GP32，而中國RAA系統中使用的是大腸桿菌SSB [24, 25, 26]。RPA/RAA反應利用三種核心酶：重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和DNA聚合酶。重組酶識別目標序列，SSB穩定反應，DNA聚合酶擴增特定的DNA片段 [27]。RAA的特點是簡化了引物設計過程（只需要一對引物）、反應速度快、操作溫度低以及儀器要求低 [28, 29, 30]。然而，當單獨使用時，RAA可能會產生非特異性擴增產物，包括引物二聚體的形成 [31] 和假陽性信號 [32]。為了克服這些限制，一些研究采用了額外的特異性增強策略，如CRISPR/Cas系統或基于Argonaute的檢測平臺 [33, 34]。
為了進一步提高檢測的特異性，Argonaute（Ago）蛋白最近作為可編程核酸酶被用于序列特異性核酸檢測 [35]。Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）是一種DNA引導的內切酶，利用短的5′-磷酸化單鏈DNA引導物（gDNAs）來指導對互補核酸目標的序列特異性識別和切割 [36]。由于其可編程性、沒有嚴格的原間隔區鄰接基序限制以及耐高溫性，PfAgo已被整合到多種擴增策略中 [37]，包括PCR、RAA、RPA和環介導的等溫擴增（LAMP），用于檢測多種病原體，如支原體 [38]、病毒 [39, 40, 41, 42] 和細菌 [37, 43]。
盡管取得了這些進展，但大多數基于PfAgo的診斷平臺主要關注分析靈敏度或檢測速度，而結果解釋仍然很大程度上依賴于絕對熒光強度或實時信號曲線。這種讀數方法在接近檢測限時容易受到信號波動和歧義的影響，特別是在臨床或野外應用中遇到的多變背景條件下。
因此，仍需要開發出不僅具有高分析靈敏度，還能提供穩健、可解釋的決策標準的基于PfAgo的診斷方法。在本研究中，我們報道了PfAgo的原核表達和純化，并建立了一種密封管式、兩階段的RAA–PfAgo檢測方法用于PCV3的檢測。除了構建檢測方法外，我們還系統評估了多種讀數模式，包括實時熒光監測、藍光下的終點視覺熒光檢測，以及一種基于半定量截斷值的分類策略，該策略借鑒了ELISA分析的方法。通過強調分析可解釋性、穩健性和操作者獨立性，這項工作旨在彌合基于可編程核酸酶的信號生成與可靠診斷實施之間的差距。
