微生物墊由多種微生物組成，這些微生物可能類似于地球上最早的生命形式（1–4）。據推測，這些生態系統在地球大氣層的氧化過程中發揮了作用，從而促成了依賴氧氣的生命形式的出現（5, 6）。分子技術的進步揭示了微生物墊各層及其微生物群落之間的生態位差異，進而發現了新的微生物及其代謝功能（7, 8）。為了評估分類學和代謝多樣性，我們采用了間接DNA提取方法，針對Fraternidad Saltern瀉湖的短暫性高鹽度微生物墊進行了研究，這種方法提高了DNA分子的回收率，便于進行功能性的宏基因組學和代謝分析（9, 10）。

底棲短暫性微生物墊樣本采集自波多黎各Cabo Rojo的Fraternidad Saltern瀉湖（坐標：17.98?N, 67.21?W），分別是在旱季和雨季采集的（11），樣本在室溫下運輸并儲存在4°C條件下。使用改良的間接提取協議提取了高分子量的DNA（12–14）。經過勻漿和洗滌后，將微生物細胞嵌入低熔點瓊脂糖中制成插件，在冰上冷卻，然后在37°C下用緩沖液（0.01 M Tris、0.05 M NaCl、0.2 M EDTA [pH 8.0]、1% sarkosyl、1% sodium deoxycholate和1 mg/mL lysozyme）處理3小時以實現細胞裂解。隨后在55°C下使用蛋白酶K（1 mg/mL）在ESP緩沖液（1% sarkosyl、0.5 M EDTA [pH 8.0]）中處理24小時進行蛋白質消化，最后用PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride；1 mM）在室溫下處理2小時以抑制酶活性。通過電泳和電洗脫方法回收分子量超過20 kb的DNA片段（13, 14）。使用NanoDrop（Thermo Scientific NanoDrop Products）對宏基因組DNA進行質量檢測（15），純化的DNA被連接到fosmid載體pCC1FOS上，并通過Epicentre MaxPlax系統包裝到lambda噬菌體中，再轉染到EPI300-T1R細胞中（16）。DNA還使用QIAGEN Plasmid Miniprep Kit進行純化、片段化、接頭連接，稀釋至4.0 nM濃度后，在Illumina MiSeq平臺上進行測序（2 × 300 bp的雙端讀取，30個循環，使用MiSeq Reagent Kit v3 https://www.mrdnalab.com/）。雨季的總克隆數為1,400個，旱季為30,000個。共生成了2,807,462條序列：旱季1,803,636條，雨季1,003,826條。原始讀取數據使用BBMap（bbmap.sh）和默認設置（ambig=all）進行過濾，以去除與參考序列（EPI300-T1R宿主基因組和pCC1FOS質粒）匹配的讀段（17）（表1）。數據分析采用了國家微生物組數據協作組織（NMDC）的標準宏基因組工作流程（18），包括質量控制（rqcfilter2 on BBTools v38.94）、組裝（MetaSPAdes v4.0.0）、基因預測（Prodigal）、分類學分類（Centrifuge v1.0.4），以及基于DRAM代謝層次模型的功能分類（19–27）。生物信息學分析工作于2025年10月完成。

圖1分析顯示，旱季和雨季的微生物墊中，Streptomyces（13.3%和10.7%）、Pseudomonas（8.7%和10.3%）以及Burkholderia（4.8%和7.0%）屬占主導地位。功能分析表明，旱季樣本在碳代謝、氨基酸生物合成和膜轉運途徑方面較為豐富；而雨季樣本則主要涉及輔因子生物合成、碳代謝和氨基酸生物合成。盡管組成相似，但季節間的分類學和功能譜的相對豐度可能受到了天氣變化的影響。

本研究得到了美國國家科學基金會（Microbial Observatory項目編號MCB-0455620）和美國農業部（USDA - CSREES 2007-02386-18042）的支持。此外，Luis R. Morales-Valle協助將序列上傳到了NCBI數據庫。