在大腦這個精密的控制中心里，維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定的“守護(hù)神”是血腦屏障。這道由血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接構(gòu)成的屏障，嚴(yán)格篩選著進(jìn)出大腦的物質(zhì)，是大腦健康運(yùn)行的關(guān)鍵防線。然而，在一些神經(jīng)發(fā)育性疾病中，這道防線可能出現(xiàn)了我們尚未完全了解的漏洞。Rett綜合征就是這樣一種由X染色體上MeCP2基因突變導(dǎo)致的嚴(yán)重神經(jīng)發(fā)育障礙，患者會出現(xiàn)語言和社交能力喪失、運(yùn)動異常和認(rèn)知障礙等癥狀。傳統(tǒng)上，研究主要聚焦于MeCP2突變對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的直接影響。然而，MeCP2蛋白在大腦的非神經(jīng)細(xì)胞，包括構(gòu)成血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)。臨床上，Rett綜合征患者常伴有生長遲緩、大腦特定區(qū)域灌注不足和循環(huán)不良等現(xiàn)象，這強(qiáng)烈暗示著大腦微血管系統(tǒng)可能也受到了損害。血管的形成和分化是大腦發(fā)育過程中最早發(fā)生的事件之一，甚至早于神經(jīng)發(fā)生。因此，發(fā)育早期的血管改變，可能會對后續(xù)的神經(jīng)發(fā)育進(jìn)程產(chǎn)生廣泛而深遠(yuǎn)的影響。那么，一個核心問題擺在面前：MeCP2突變究竟是否會損害腦血管的完整性？如果會，其背后的分子機(jī)制是什么？這一血管層面的病變，是否與Rett綜合征的神經(jīng)癥狀存在關(guān)聯(lián)？為了回答這些問題，一項(xiàng)發(fā)表在《Molecular Psychiatry》上的研究展開了深入探索。

為了開展研究，研究人員運(yùn)用了幾個關(guān)鍵技術(shù)方法：首先，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)的ETV2基因盒定點(diǎn)插入到源自Rett綜合征患者（攜帶MeCP2[R306C]或MeCP2[R168X]突變）及其同基因?qū)φ盏恼T導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）的AAVS1安全港位點(diǎn)，從而建立了能夠快速、穩(wěn)定分化為內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞系。其次，將分化得到的內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞一起嵌入纖維蛋白凝膠，置于微流控芯片中，成功構(gòu)建了仿生的三維微血管網(wǎng)絡(luò)模型，用以模擬體內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)并評估其功能。最后，綜合運(yùn)用了RNA測序、微小RNA（miRNA）表達(dá)譜分析、成像流式細(xì)胞術(shù)以及鈣成像等技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄組、細(xì)胞形態(tài)和功能等多個層面，系統(tǒng)分析了突變內(nèi)皮細(xì)胞的特性及其對神經(jīng)元活性的潛在影響。

研究人員首先從攜帶MeCP2[R306C]突變的Rett綜合征患者iPS細(xì)胞及其同基因?qū)φ占?xì)胞出發(fā)，通過CRISPR/Cas9技術(shù)將強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的ETV2表達(dá)盒插入AAVS1位點(diǎn)，建立了穩(wěn)定的誘導(dǎo)型內(nèi)皮細(xì)胞分化體系。測序證實(shí)了突變位點(diǎn)，Western blot顯示ETV2可在添加強(qiáng)力霉素后有效誘導(dǎo)表達(dá)，且基因編輯后的iPS細(xì)胞仍保持多能性。

誘導(dǎo)ETV2表達(dá)的iPS細(xì)胞經(jīng)過定向分化，成功獲得了表達(dá)CD31、CD34、VEGFR2等典型內(nèi)皮標(biāo)記物的iPS細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞。然而，與對照細(xì)胞相比，Rett綜合征來源的內(nèi)皮細(xì)胞其緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)降低且定位異常，ZO-1、OCLDN、CLDN5等緊密連接相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著下調(diào)。同時(shí)，這些細(xì)胞的跨內(nèi)皮電阻值降低，提示其屏障功能受損。RNA測序分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Rett綜合征內(nèi)皮細(xì)胞中與“血管發(fā)育調(diào)控”和“蛋白質(zhì)向細(xì)胞間連接定位”相關(guān)的通路顯著下調(diào)。

通過成像流式細(xì)胞術(shù)對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞水平的分析發(fā)現(xiàn)，Rett綜合征來源的內(nèi)皮細(xì)胞存在明顯的細(xì)胞周期異常，更多地停滯在S期。基于細(xì)胞形態(tài)參數(shù)的聚類分析顯示，高表達(dá)ZO-1的細(xì)胞簇在對照組中比例更高，而在突變組中比例較低，從單細(xì)胞層面印證了突變內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接完整性的缺陷。

為了在更接近生理的三維環(huán)境中評估血管功能，研究人員在微流控器件中構(gòu)建了三維微血管網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，雖然突變組和對照組都能形成可灌注的血管網(wǎng)絡(luò)，但Rett綜合征來源的血管網(wǎng)絡(luò)直徑略小，并且對70 kDa葡聚糖的通透性顯著高于對照組，表明其血管屏障功能存在缺陷。免疫染色顯示三維血管網(wǎng)絡(luò)中ZO-1的強(qiáng)度也較低。此外，培養(yǎng)基中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP8及其抑制劑TIMP1的分泌水平出現(xiàn)異常。

為了探究機(jī)制，研究人員關(guān)注了內(nèi)皮細(xì)胞特異性的微小RNA miR-126-3p。他們發(fā)現(xiàn)，在Rett綜合征來源的內(nèi)皮細(xì)胞中，miR-126-3p的表達(dá)水平顯著上調(diào)。通過miRNA-mRNA整合分析預(yù)測并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其多個靶基因（如EGFL7、SPRED1、PIK3R2）表達(dá)下調(diào)。尤為重要的是，分析指出Angiopoietin-1受體（TEK）和內(nèi)皮素-1（EDN1）這兩個對血管穩(wěn)定和功能至關(guān)重要的基因表達(dá)下調(diào)，且與miR-126-3p的調(diào)控相關(guān)。

為了確認(rèn)miR-126-3p的功能，研究團(tuán)隊(duì)在Rett綜合征內(nèi)皮細(xì)胞中敲低了miR-126-3p。結(jié)果顯示，這不僅能部分恢復(fù)三維血管網(wǎng)絡(luò)中ZO-1的表達(dá)，還能顯著改善血管的通透性。同時(shí)，TEK、EDN1以及緊密連接蛋白CLDN5的基因表達(dá)水平也得到了恢復(fù)。這表明miR-126-3p的上調(diào)是導(dǎo)致MeCP2突變內(nèi)皮細(xì)胞血管屏障功能受損的關(guān)鍵介質(zhì)。

本研究的發(fā)現(xiàn)首次在人類細(xì)胞模型中系統(tǒng)揭示了MeCP2突變通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞特異性miR-126-3p，進(jìn)而損害血管完整性的新機(jī)制。具體而言，miR-126-3p的異常高表達(dá)導(dǎo)致其靶基因TEK（Tie2）和EDN1等下調(diào)，擾亂了Ang/Tie2信號通路，最終造成緊密連接蛋白表達(dá)減少和血管通透性增加。這一機(jī)制在兩種不同的MeCP2突變（R306C和R168X）中均得到驗(yàn)證，提示其可能是MeCP2功能缺失相關(guān)的普遍表型。

該研究的意義重大。首先，它突破了傳統(tǒng)上僅從神經(jīng)元角度理解Rett綜合征的局限，將血管功能障礙確立為疾病病理生理學(xué)的一個重要組成部分，為理解患者臨床上觀察到的循環(huán)和灌注問題提供了細(xì)胞分子機(jī)制的解釋。其次，研究建立了首個基于患者iPS細(xì)胞的三維Rett綜合征血管模型，這套結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯、定向分化與微流控器官芯片技術(shù)的平臺，為在人類背景下研究神經(jīng)發(fā)育疾病的血管病變提供了強(qiáng)大工具。最后，也是最具有轉(zhuǎn)化前景的一點(diǎn)，研究明確指出miR-126-3p是一個潛在的治療靶點(diǎn)。通過反義寡核苷酸等手段下調(diào)miR-126-3p，能夠有效逆轉(zhuǎn)血管屏障功能的缺陷。考慮到miR-126在多種血管疾病中的作用，以及已有針對它的抑制劑（如miRisten）進(jìn)入臨床試驗(yàn)，本研究為將血管靶向治療策略應(yīng)用于Rett綜合征，乃至其他存在血管功能障礙的神經(jīng)發(fā)育性或神經(jīng)退行性疾病，開辟了新的思路和可能性。