細胞膜是充滿脂質的動態結構，它們包裹著細胞及其內部的各種細胞器。理解脂質在緊密堆積的膜環境中如何被代謝、組織和交換，需要能夠繪制細胞器特異性脂質網絡及其相關蛋白質機器的強大策略。來自化學生物學領域的最新進展，提供了一系列功能強大且精確的工具，可在細胞器水平上探測脂質，實現脂質庫的高時空分辨率可視化、定量和操縱。這些方法包括定制的小分子化學探針以及精心設計的工程蛋白工具。這些化學策略共同擴展了我們解析脂質動力學的能力，并為理解基礎的細胞脂質穩態及相關疾病機制提供了新見解。

識別單個脂質的亞細胞分布并揭示其被運送到不同細胞器的途徑，是膜生物學中重要的知識空白。迄今為止，一系列化學工具已經出現以填補這些空白。這些方法可大致分為三類：(i) 基于重氮嗪的光交聯探針；(ii) 可點擊脂質前體的代謝摻入；(iii) 用于標記天然脂質的光催化劑策略。

Nadler及其同事最近報告了一種使用經過最小修飾的雙功能光親和探針來追蹤不同脂質物種的策略。這些合成的脂質探針在酰基尾部帶有一個小的重氮嗪基團用于光交聯，末端帶有炔基用于通過點擊化學進行熒光標記。結合高分辨率熒光成像、AI輔助分割和傅里葉變換質譜分析，作者克服了這些障礙，并量化了整個細胞器網絡中的脂質交換和代謝。動力學分析表明，由脂質轉運蛋白介導的非囊泡脂質運輸是所檢查的大多數細胞器間脂質通量的原因，該運輸主要是逆向的，并且比囊泡脂質運輸具有更高的脂質特異性。此外，基因擾動實驗表明，LTP和ATP驅動的脂質轉位共同作用，指導脂質運輸以維持細胞器膜的組成和不對稱性。這項研究為追蹤脂質物種建立了一個定量框架，并為脂質動力學的機理研究構建了一個可推廣的平臺。

H?glinger課題組開發了三功能脂質探針，與上述雙功能探針相比，它們加入了一個光籠化的香豆素基團以實現溶酶體靶向。這些探針能夠在溶酶體內實現細胞器特異性遞送和光觸發釋放鞘氨醇和膽固醇。通過這種方法，作者證明了膽固醇轉運蛋白也參與了鞘氨醇從溶酶體中的輸出。

磷脂酰膽堿(PC)在細胞膜中含量豐富，因此，使用炔基或疊氮修飾的膽堿前體進行代謝標記通常缺乏細胞器特異性。然而，通過將這些脂質與細胞器靶向染料通過應變促進的炔-疊氮環加成生物正交反應偶聯，可以實現選擇性的細胞器可視化，從而在質膜、內質網和線粒體處進行檢測。Hamachi、Tamura和同事用這種方法為自噬體膜源自內質網膜提供了直接證據。除了PC，該策略也適用于疊氮修飾的脂肪酸，以實現對跨不同亞細胞庫的脂肪酸檢測。

本課題組開發的另一種方法同樣依賴于PC的代謝標記，其細胞器選擇性是通過一系列膽堿類似物的結構特征而非用于生物正交化學檢測步驟的細胞器導向染料來實現的。我們利用了通用有機陽離子轉運蛋白(OCT1)的過表達來促進這些合成的帶電膽堿類似物的攝取。通過磷脂酶D介導的轉磷脂酰化反應，這些探針被摻入PC類似物中，經過細胞器間運輸后，分布到不同的亞細胞位置。這種方法通過在特定膜上提供一個可點擊的柄，還可用于錨定生物活性分子以調節細胞信號通路。

光驅動光催化的日益廣泛應用極大地推進了鄰近標記蛋白質組學，與廣泛使用的基于蛋白質的工具相比，提供了改進的時空分辨率。這些方法涉及將小分子有機金屬光催化劑或有機光敏劑連接到感興趣的蛋白質上，從而催化激活附近的具有光反應活性的探針，用于相互作用組分析。此外，有機染料衍生的光催化劑因其優異的細胞滲透性和亞細胞定位，為基于金屬的系統提供了一個有前景的替代方案。盡管光催化鄰近標記近年來被廣泛應用于蛋白質相互作用組作圖，但其用于追蹤其他生物分子的應用仍然有限。通過調整鄰近標記用于脂質分析，Zhu及其同事使用定位光催化染料研究了細胞中細胞器特異性的脂質組成和運輸。作者開發了一種用于脂質標記的光活化苯基疊氮探針，使用有機染料作為光催化劑。該探針包含一個疏水性接頭以增加其親脂性和膜結合力，以及一個電離增強子以提高質譜檢測。在藍光照射下，苯基疊氮產生反應性三重態氮賓，最終與豐富的PE和PS脂質的親核脂質頭部基團發生共價修飾。通過將具有不同細胞器親和力的染料基光催化劑結合，作者實現了在線粒體、細胞核和溶酶體中的細胞器特異性脂質標記。

總之，這些方法各有優缺點。例如，基于天然脂質衍生化的標記策略（如雙和三功能重氮嗪脂質）在追蹤單個脂質物種方面很強大，但它們通常容易受到快速代謝重塑或內源酶降解的影響。因此，長時間標記通常會導致脂質身份丟失，使下游分析復雜化。這些脂質探針的疏水性也使其難以遞送進入細胞。為了應對這一限制，可使用水溶性更好的脂質前體，不過這些探針通常需要更長的標記時間以確保充分的膜摻入。基于光催化劑的標記規避了探針代謝問題，但這些方法目前主要依賴于質譜讀數，缺乏解析動態細胞器間脂質運輸的空間分辨率。這些局限性凸顯了該領域對整合了代謝穩定性、高效遞送和細胞器間脂質運輸空間分辨測量的細胞內化學工具的迫切需求。

除了小分子和脂質類似物，工程蛋白也成為探究細胞器脂質生物學的有力工具。Budin及其同事開發了一種稱為熒光原激活共現傳感(FACES)的策略，該策略整合了疊氮膽堿代謝物、可點擊熒光原和細胞器靶向的熒光原激活蛋白(FAPs)。這種方法利用了每個組件的優勢，在特定膜內實現對脂質庫的高度選擇性可視化。在FACES設置中，基因編碼的非熒光FAP通過融合細胞器靶向序列被錨定在目標細胞器膜小葉上。隨后，細胞被提供疊氮膽堿類似物，該類似物通過肯尼迪途徑和隨后的細胞器間脂質運輸，代謝摻入幾乎所有細胞膜中的PC。然后通過生物正交SPAAC標記將非熒光小分子探針（熒光原）連接到疊氮PC物種上，只有當熒光原標記的脂質與細胞器限制性的FAP結合時，熒光才會被觸發。作者進一步證明，FACES不僅限于對PC的細胞器庫進行成像，還可應用于非脂質代謝物，如在線粒體內膜上觀察到的O-GlcNAc修飾的糖蛋白。這些發現凸顯了FACES作為一種檢測低豐度生物分子的非常靈敏的方法。

為解決監測細胞器間脂質運輸的問題，Kornmann及其同事開發了一種稱為質量標記細胞脂質追蹤(METALIC)的酶促標記方法，該方法通過一對酶在運輸的脂質上安裝不同的質量標簽來監測細胞器間的脂質交換。在這個雙酶系統中，內質網定位的PE甲基轉移酶(PEMT)在將PE轉化為PC的過程中，用同位素標記的甲基基團標記乙醇胺頭部基團，而外源表達的細菌環丙烷脂肪酰基磷脂合酶(CFAse)在不飽和酰基尾部安裝一個獨特的同位素標記的環丙烷基團。通過將這些酶定位在選定的細胞器上，并利用含有氘的甲硫氨酸進行穩定同位素代謝標記，METALIC能夠通過細胞內質量標記和體外基于質譜的脂質組學分析，監測酵母和哺乳動物細胞中的細胞器間脂質運輸。

我們最近引入了一種“喂養與垂釣”策略，以識別在細胞器水平上調節PA穩態的蛋白質。在這種方法中，一種藍光控制的超活性磷脂酶D（superPLD）——稱為光遺傳學膜編輯器——用于在目標膜上“喂養”PA，而一種膜錨定的TurboID則“垂釣”附近的蛋白質。同時使用這對工程蛋白模塊，可以在同一細胞器實現受控的PA升高和相關蛋白質組變化的檢測，從而揭示在富含PA與缺乏PA的細胞器膜上被募集或排斥的蛋白質，作為PA代謝穩態的潛在調節因子。我們發現，幾種PA代謝酶和LTP共同作用，以降低質膜和溶酶體膜胞質小葉局部升高的PA水平。值得注意的是，除了已知的PA轉運蛋白Nir2，我們還發現另一種LTP——固醇載體蛋白2(SCP2)，在體外和細胞內也能促進PA的轉運。總的來說，這種方法能夠系統地識別PA調節因子，并為了解控制PA穩態和細胞器間運輸的途徑提供了見解。

除了使用“喂養-垂釣”策略系統地識別PA調節因子外，我們還利用生物正交探針，通過將PLD催化的轉磷脂酰化與快速的應變促進生物正交點擊反應相結合，來表征某些介導磷脂從質膜到內質網運輸的LTP。通過基因擾動，我們證明了來自擴展突觸結合蛋白家族的LTP能夠運輸PLD生成的熒光磷脂，這表明這些生物正交脂質探針可以作為細胞中擴展突觸結合蛋白脂質轉運活性的報告分子。

化學生物學工具改變了我們可視化、操縱和量化細胞器間脂質運動的能力。在這篇綜述中，我們重點介紹了這些工具的最新進展，強調了它們在繪制細胞器脂質分布與動力學、揭示運輸途徑以及識別維持膜組成的蛋白質方面的影響。然而，這些方法并非沒有局限。一個關鍵問題是，考慮到即使對脂質物理化學性質進行微小的化學修飾也會產生影響，那么帶有可點擊柄、光交聯劑或熒光團的合成探針是否能準確再現內源脂質的行為。此外，許多脂質物種缺乏合適的代謝標記前體，這限制了諸如FACES等方法在可視化特定類型脂質運輸中的應用。細胞器特異性染料標記和細胞器靶向光催化標記等方法提供了選擇性，但其適用性可能局限于某些細胞器。未來在細胞器特異性脂質標記方面的努力，將受益于將這些方法應用到更多的細胞器，以及設計能更緊密地模擬天然脂質行為的、更接近天然狀態的探針。