《Developmental & Comparative Immunology》：An Improved Comprehensive Method for Collecting Single Nuclei from Shrimp Ovaries
編輯推薦：
單細(xì)胞測序技術(shù)優(yōu)化用于凡納濱對蝦卵巢組織單核分離，通過調(diào)整裂解方法（0.1% NP40手動研磨5分鐘）、離心策略（高低速離心結(jié)合碘ixanol固定）及質(zhì)量控制（HE染色、電鏡觀察），顯著提升核回收率至40.56%，減少細(xì)胞團(tuán)塊和碎片，為 crustacean 深層組織單細(xì)胞研究提供標(biāo)準(zhǔn)化方案。
顏梅桐|歐陽慧敏|劉青云|胡曉東|黃玉柳|楊春玲|彭敏|陳天聰|張斌|陳秀麗|胡廷軍|王帆|趙永珍
廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，中國南寧530005
摘要
單核測序是研究卵巢發(fā)育的強(qiáng)大工具。然而，目前尚缺乏針對甲殼類動物的標(biāo)準(zhǔn)化單核分離方案。在本研究中，首次系統(tǒng)優(yōu)化了Litopenaeus vannamei核懸浮液的制備關(guān)鍵參數(shù)，采用了HE染色、臺盼藍(lán)染色、掃描電子顯微鏡觀察、10× Genomics質(zhì)量控制數(shù)據(jù)以及t-SNE圖譜等評估方法。結(jié)果表明，新鮮卵巢組織的最佳裂解效率是通過使用0.1% NP40手動研磨5分鐘實現(xiàn)的，同時該方法保證了核的質(zhì)量。此外，還采用了碘辛醇輔助法來減少離心過程中對核的機(jī)械損傷，顯著提高了核的回收率。為了捕獲盡可能多的核類型，我們結(jié)合了高速和低速離心，提高了核的回收率并減少了數(shù)據(jù)偏差。蝦卵巢樣本的處理時間可在40分鐘或更短時間內(nèi)完成。通過優(yōu)化方法從蝦卵巢中分離出的單核細(xì)胞形狀均勻、邊界清晰，團(tuán)塊和雜質(zhì)顯著減少，上清液中的核殘留物極少。核的回收率從4.78%提高到了40.56%。本研究填補(bǔ)了L. vannamei生殖系統(tǒng)單細(xì)胞研究的空白，為甲殼類動物復(fù)雜組織樣本中核懸浮液的制備提供了新的方向和見解。
引言
Litopenaeus vannamei（羅非蝦）是全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最重要的經(jīng)濟(jì)物種之一，因其生長迅速和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性而受到廣泛關(guān)注（Wu等人，2022年；Yuan等人，2023年）。卵巢是L. vannamei生殖研究的關(guān)鍵器官，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含生殖細(xì)胞和體細(xì)胞，如卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、卵泡細(xì)胞和免疫細(xì)胞（Phinyo等人，2018年；Tinikul等人，2011年）。探索L. vannamei卵巢在不同發(fā)育階段的分子變化和細(xì)胞相互作用對于優(yōu)化養(yǎng)殖策略和推動蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。
近年來，單細(xì)胞技術(shù)，特別是單核RNA測序（snRNA-seq）發(fā)展迅速，成為研究復(fù)雜組織中細(xì)胞異質(zhì)性的強(qiáng)大工具（Luo等人，2024年；Zhang等人，2023年）。該技術(shù)特別適用于處理細(xì)胞直徑較大且形態(tài)不規(guī)則的樣本（Santo等人，2024年；Zeng等人，2016年）。McGlacken-Byrne等人（2025年）利用snRNA-seq鑒定人類卵巢細(xì)胞中的基因表達(dá)特征并分析神經(jīng)內(nèi)分泌信號傳導(dǎo)。Petrany等人（2020年）使用snRNA-seq研究了小鼠不同發(fā)育階段多核肌纖維中的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，揭示了肌核在發(fā)育中的關(guān)鍵作用。除了哺乳動物，snRNA-seq還應(yīng)用于其他物種的復(fù)雜組織，包括雞的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)（Leng等人，2024年）、大西洋鮭魚的頭部腎臟組織（Andresen等人，2024年）、果蠅的神經(jīng)組織（McLaughlin等人，2021年）以及螃蟹的卵巢組織（Lu等人，2025年）。然而，與哺乳動物相比，包括甲殼類動物在內(nèi)的低等生物的單細(xì)胞研究仍處于早期階段。現(xiàn)有的關(guān)于蝦的單細(xì)胞研究主要集中在免疫細(xì)胞上，例如血細(xì)胞亞型的分化及其在病理過程中的免疫反應(yīng)（Cui等人，2022年、2024年；Liang等人，2023年；Zhu等人，2022年），而對生殖系統(tǒng)的研究仍然有限。因此，利用snRNA-seq技術(shù)構(gòu)建L. vannamei卵巢的細(xì)胞圖譜具有重要意義。
制備核懸浮液是snRNA-seq的關(guān)鍵步驟。研究表明，核的回收率、完整性和多樣性直接影響下游測序的可靠性和數(shù)據(jù)質(zhì)量（Garcia-Flores等人，2023年）。已經(jīng)建立了針對哺乳動物細(xì)胞的成熟核懸浮液制備方案（Jiao等人，2026年；Ma等人，2025年；Slyper等人，2020年；Waag和Bohacek，2023年）。然而，不同物種間組織結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)的顯著差異可能限制了該方法的適用性。Yao等人（2024年）在羅非魚卵巢研究中使用含有1.0% BSA的PBS緩沖液，并以500 ×g離心5分鐘來收集核。Wang等人（2024年）在牡蠣研究中使用含0.01% BSA的PBS緩沖液來保護(hù)卵巢中的核。McLaughlin等人（2022年）通過手動研磨并以1000 ×g離心10分鐘從果蠅卵巢中獲得了高質(zhì)量的核樣本。這些研究表明，不同物種制備核懸浮液的最佳條件各不相同，我們必須根據(jù)L. vannamei卵巢組織的特點制定針對性的策略。
本研究旨在優(yōu)化多個參數(shù)，包括樣本預(yù)處理、裂解緩沖液濃度、裂解方法、處理時間和離心條件，以建立有效的L. vannamei卵巢核懸浮液制備方案。我們的研究填補(bǔ)了L. vannamei生殖系統(tǒng)snRNA-seq研究的空白，為探索蝦卵發(fā)生和發(fā)育的單細(xì)胞機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
實驗部分
動物
本研究使用的所有健康雌性L. vannamei（90天大）均來自中國南寧廣西漁業(yè)科學(xué)院的L. vannamei遺傳育種中心。
儀器和試劑
儀器和試劑的來源分別列于表1和表2中。本研究中使用的工作溶液按照表3、表4和表5中的配方制備。所有制備好的試劑均在4°C下保存直至使用。卵巢組織解剖
隨機(jī)選取三只蝦，并將其標(biāo)記為樣本1。
蝦卵巢組織的組織學(xué)觀察
三個蝦樣本的平均體重為21.0克±0.83克，GSI為0.182%±0.015%（圖1C）。解剖后，卵巢呈半透明狀，無粘連現(xiàn)象（圖1B）。HE染色（圖1D）顯示卵巢核的直徑范圍為2.1微米至24.3微米，均小于40微米，符合10× Genomics平臺的要求。
核懸浮液制備的優(yōu)化
核懸浮液的制備遵循圖2A所示的技術(shù)流程。
討論
本研究使用10× Genomics Chromium系統(tǒng)對L. vannamei卵巢組織進(jìn)行snRNA-seq分析。由于液滴尺寸的限制，系統(tǒng)要求輸入樣本的直徑小于40微米（Denisenko等人，2020年）。通過HE組織切片染色發(fā)現(xiàn)，蝦卵巢樣本的核直徑范圍為2.1微米至24.3微米，符合系統(tǒng)要求，證明該系統(tǒng)適用于L. vannamei卵巢的snRNA-seq分析。
結(jié)論與展望
總之，本研究首次系統(tǒng)優(yōu)化了L. vannamei卵巢核懸浮液的制備方法，并創(chuàng)新性地提出了新的甲殼類動物研究方法，包括使用新鮮樣本、碘辛醇分層以及結(jié)合高速和低速離心。通過優(yōu)化方法從蝦卵巢中分離出的單核細(xì)胞形狀均勻、邊界清晰，團(tuán)塊和雜質(zhì)顯著減少，上清液中的核殘留物極少。
作者貢獻(xiàn)聲明
陳天聰：研究工作。
張斌：監(jiān)督、資源協(xié)調(diào)、概念設(shè)計。
陳秀麗：資金籌集、數(shù)據(jù)管理。
胡廷軍：驗證、方法學(xué)研究。
胡曉東：方法學(xué)研究、數(shù)據(jù)收集。
黃玉柳：項目管理、數(shù)據(jù)收集。
楊春玲：驗證、資源協(xié)調(diào)。
彭敏：寫作、審稿與編輯、數(shù)據(jù)分析。
歐陽慧敏：數(shù)據(jù)可視化、驗證、數(shù)據(jù)分析。
趙永珍：寫作、審稿與編輯、項目管理、資金協(xié)調(diào)
未引用文獻(xiàn)
Sandoval等人，2023年；Schm?kel等人，2023年；Sharifian和Norouzi，2023年。
數(shù)據(jù)可用性聲明
部分或所有研究過程中生成或使用的數(shù)據(jù)、模型或代碼可向相應(yīng)作者索取。
利益沖突聲明
本研究不存在任何利益沖突。
致謝
本工作得到了“廣西科技創(chuàng)新計劃‘新型高產(chǎn)抗病羅非蝦品種培育’項目”（項目編號：GK AA23062046）以及國家自然科學(xué)基金“Blimp1調(diào)控蝦巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞免疫活性的機(jī)制研究”（項目編號：32373169）、國家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-48-02）和廣西農(nóng)業(yè)科技自籌項目的財政支持。
