近年來，高致病性禽流感（HPAI）尤其是H5N1毒株的持續暴發，對美國乃至全球的家禽業構成了巨大威脅。自2022年首次暴發以來，已影響了全美50個州的超過1.68億只家禽。這一現狀凸顯了僅依靠生物安全措施不足以有效防控疾病，迫切需要開發更有效的治療和疫苗策略。然而，一個關鍵障礙在于我們對雞免疫系統的理解仍然有限，特別是對其先天抗病毒免疫應答和I型干擾素（Interferon, IFN）反應背后的分子機制知之甚少。

在哺乳動物中，I型干擾素反應主要由干擾素調節因子（Interferon Regulatory Factors, IRF）家族調控，其中IRF9是一個核心的轉錄調節因子。它能與STAT1、STAT2形成干擾素刺激基因因子3（Interferon-stimulated gene factor 3, ISGF3）復合體，進入細胞核激活數百個干擾素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs），從而建立抗病毒狀態。但長期以來，IRF9被認為在雞基因組中缺失。直到最新的雞參考基因組注釋（bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b）中，才列出了一個推定的雞IRF9基因。這個基因到底是不是真正的IRF9？它在雞的免疫防御中扮演什么角色？是與哺乳動物中的“正牌”IRF9功能一致，還是另有所職？這些問題都懸而未決。鑒于雞與哺乳動物免疫系統存在顯著差異，其免疫基因庫相對縮減（例如，關鍵的免疫調節因子IRF3和RIG-I在雞中也被認為缺失），簡單地將哺乳動物的知識套用在雞身上是危險的。因此，對雞IRF9進行功能驗證，對于理解禽類獨特的免疫機制、應對禽流感等疾病至關重要。

為了揭開雞IRF9的神秘面紗，來自賓夕法尼亞州立大學的研究團隊在《Developmental 》上發表了一項研究。他們巧妙地運用了前沿的CRISPR基因調控技術，扮演了一次細胞內的“基因音量調節師”，對雞IRF9進行精準的“調低”和“調高”，并結合轉錄組學分析，深入探究了其在雙鏈RNA（dsRNA）模擬病毒感染刺激下的先天免疫應答中的功能。

研究者主要運用了幾項關鍵技術：首先，他們利用CRISPR抑制（CRISPRi）系統，構建了穩定表達dCas9-KRAB融合蛋白的雞胚成纖維細胞（DF-1）系，實現了對IRF9基因轉錄的內源性靶向抑制。其次，他們采用了CRISPR激活（CRISPRa）與抑制（CRISPRi）的雙系統，在同一個細胞中同時實現一個基因的激活和另一個基因的抑制，用于研究基因間的相互作用（上位性分析）。研究的核心樣本是經過工程化改造的DF-1細胞系。最后，對經過不同處理的細胞進行雙鏈RNA（poly(I:C)）刺激以模擬病毒感染，并在多個時間點（0、0.5、1、6小時）收集樣本，通過高通量RNA測序（RNA-seq）和定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）來全面分析基因表達的變化。數據分析則運用了基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）來挖掘通路水平的變化。

研究人員首先通過AlphaFold3預測了雞IRF9的蛋白質結構，發現其具有兩個明顯的結構域，符合IRF蛋白特征。進一步的氨基酸序列比對顯示，雞IRF9的DNA結合域（DBD）和蛋白質相互作用域（PID）與其他物種的IRF9/IRF10序列具有保守性。有趣的是，雞IRF9與爪蟾和斑馬魚的IRF10相似度最高，而非其他物種的IRF9。這從序列上暗示了雞IRF9可能更接近IRF10家族。

研究團隊成功開發了穩定表達dCas9-KRAB的DF-1細胞系，并通過PCR和測序確認了該序列整合到了組成型表達的GAPDH基因位點。他們設計了9個靶向IRF9轉錄起始位點不同位置的引導RNA（gRNA），并鑒定出gRNA 3和5能最有效地抑制IRF9表達，抑制效率最高可達63%，為后續功能研究建立了有效的平臺。IRF9的抑制效率。(A) 靶向GAPDH基因3‘端的插入載體示意圖。(B) PCR確認dCas9-KRAB插入的左右同源臂。(C) 九個靶向雞IRF9轉錄起始位點不同位置gRNA的示意圖。(D) 使用不同gRNA后雞IRF9表達的相對變化。">

在利用CRISPRi抑制IRF9后，用dsRNA刺激細胞并分析轉錄組。雖然單個差異表達基因數量有限，但通過GSEA分析在通路水平上發現了顯著變化。在未受刺激時（0小時），IRF9敲低導致RIG-I樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路顯著富集。此外，核糖體通路在多個時間點呈現負富集，直到6小時后才轉為正富集。這表明IRF9的缺失可能影響了細胞的基礎免疫監視狀態和代謝平衡。IRF9抑制導致的KEGG通路富集分析。(A) 各時間點最富集的KEGG通路及其歸一化富集分數點圖。(B-D) 關鍵通路的GSEA圖：核糖體通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路。">

對比0到6小時dsRNA刺激后的基因表達變化，Mock（對照）和IRF9敲低組共有213個共同的差異表達基因，但也分別有164個和79個獨特的差異基因。對共同差異基因的分析顯示，它們富集在類固醇生物合成、細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路和甲型流感通路等。對23個先天抗病毒免疫相關基因的動力學分析發現，細胞因子信號抑制物SOCS1和SOCS3在IRF9敲低組的表達在6小時時更高，而主要組織相容性復合體II類反式激活因子CIITA的表達則更低。這些變化提示IRF9可能參與免疫負反饋調節以及先天免疫向適應性免疫的過渡。IRF9敲低細胞中免疫基因的時間分析。(A) Mock和IRF9KD細胞在dsRNA刺激后0至6小時的差異表達基因。(B) 6小時時Mock和IRF9KD組差異基因的韋恩圖。(C) 三組差異基因富集的KEGG通路。(D) 23個先天抗病毒免疫基因在Mock和IRF9KD組中表達模式的熱圖。">

為了測試IRF9能否在I型干擾素通路被阻斷時“力挽狂瀾”，研究者使用了雙CRISPRa/i系統，在同一個細胞中同時抑制I型干擾素的主調控因子IRF7（CRISPRi）并激活IRF9（CRISPRa）。實驗成功實現了IRF7的顯著抑制（74%）和IRF9的顯著激活（110%）。然而，盡管IRF9被過表達，下游的兩個典型干擾素刺激基因MX1和PKR的表達依然被顯著抑制，未能得到挽救。這一關鍵實驗結果表明，在雞的I型干擾素通路中，IRF9的單獨過表達不足以繞開上游IRF7的調控來啟動下游應答。IRF9的上位性分析。(A) IRF7抑制和IRF9過表達的相對變化。(B) 下游MX1和PKR基因的表達情況。">

本研究通過一系列實驗得出核心結論：雞的IRF9在先天免疫應答中扮演著與經典哺乳動物IRF9不同的調控角色。首先，序列分析表明雞IRF9在進化上更接近于其他物種的IRF10。功能上，在靜息狀態下抑制IRF9，反而導致RIG-I樣受體和Toll樣受體這兩個關鍵的病原體識別通路被激活，這出乎意料，因為哺乳動物中IRF9通常正調控這些通路的下游。其次，在動態應答中，IRF9的缺失影響了如SOCS1/3（負反饋調節因子）和CIITA（連接先天與適應性免疫）等基因的表達模式，暗示其可能參與免疫應答的晚期調節和負向調控。最有力的證據來自上位性分析：當過表達IRF9時，無法挽救因IRF7缺失而導致的下游干擾素刺激基因表達抑制，這與哺乳動物中ISGF3復合體功能的經典認知相悖。綜合這些發現，研究指出，不能僅依據基因注釋和命名來推斷其在雞中的功能，雞IRF9可能并非經典ISGF3復合體的核心正調控元件，而可能具有更復雜或獨特的免疫調節功能，或許更類似于IRF10在某些魚類中表現的負調控或晚期調控角色。

這項研究的重要意義在于：它首次利用CRISPRi/a這一精細的轉錄調控工具，在雞細胞中對新注釋的IRF9進行了深入的功能解析，為理解禽類獨特的I型干擾素信號網絡提供了嶄新的視角。研究結果挑戰了基于哺乳動物模型的外推假設，強調了跨物種進行功能性基因驗證的必要性。這不僅深化了我們對鳥類基礎免疫學的認識，也為未來針對高致病性禽流感等禽類重大疫病，開發基于宿主靶點的新型抗病毒策略或免疫增強劑奠定了重要的理論基礎。同時，研究中所建立和優化的CRISPR轉錄調控平臺，也為禽類功能基因組學研究提供了強有力的技術手段。