《Developmental & Comparative Immunology》：Immune cell profiling in the sand dollar
Mellita quinquiesperforata (Leske, 1778) (Echinodermata: Echinoidea): morphology, phagocytosis, and ABC transporters activity
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本研究聚焦于不規(guī)則海膽代表——五孔餅海膽（Mellita quinquiesperforata）的免疫系統(tǒng)，其體腔細胞（coelomocytes）研究相對匱乏。研究人員系統(tǒng)鑒定了該物種的四種體腔細胞類型及其豐度，并首次評估了其吞噬活性與ABC（ATP結(jié)合盒）轉(zhuǎn)運蛋白（特別是ABCC1）的活性特征。結(jié)果揭示了其獨特的細胞組成與功能，為理解棘皮動物免疫系統(tǒng)多樣性提供了新見解，并凸顯了該物種作為熱帶沿海環(huán)境監(jiān)測生物標(biāo)志物的潛力。
在浩瀚的海洋中，棘皮動物是一個古老而獨特的類群，包括我們熟悉的海星、海參和海膽。它們沒有像脊椎動物那樣的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，而是完全依賴一套精密的先天性免疫機制來抵御病原體入侵。在這套機制中，體腔細胞（coelomocytes）扮演著核心角色，它們是存在于體腔液中的免疫細胞，負責(zé)吞噬異物、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等多種防御功能。盡管對于“規(guī)則”海膽（如常見的球形海膽）的體腔細胞已有較多研究，但對于形態(tài)扁平、棲息于沙灘的“不規(guī)則”海膽——如餅海膽（sand dollar）——其免疫細胞的“家底”卻知之甚少。這種認知的不平衡，限制了我們?nèi)胬斫饧游锩庖呦到y(tǒng)的進化與多樣性。
為了解決這一問題，研究人員將目光投向了廣泛分布于西大西洋熱帶沿岸的五孔餅海膽（Mellita quinquiesperforata）。這種生物易于采集和實驗室處理，且因其底棲習(xí)性和高豐度，被認為是潛在的環(huán)境生物指示劑。然而，要想將其有效應(yīng)用于環(huán)境健康評估，首先必須深入了解其免疫系統(tǒng)的基本構(gòu)成與功能狀態(tài)。為此，研究團隊開展了一項系統(tǒng)性的研究，旨在繪制五孔餅海膽的免疫細胞圖譜，并評估其關(guān)鍵的免疫功能參數(shù)。相關(guān)研究成果已發(fā)表在《Developmental 》期刊上。
為達成研究目標(biāo)，作者團隊運用了多項關(guān)鍵實驗技術(shù)。樣本來源于巴西帕拉伊巴州 Ponta-de-Campina 海灘采集的活體五孔餅海膽。在細胞形態(tài)與鑒定方面，他們結(jié)合了光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡技術(shù)，并使用SYBR Green（核酸染料）和TMRE（線粒體染料）對活細胞進行染色觀察。細胞計數(shù)采用血球計數(shù)板進行總細胞和分類細胞計數(shù)。在功能分析上，吞噬功能通過讓細胞與熒光乳膠微球共孵育，再使用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡進行定量與定性分析。ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性則采用經(jīng)典的鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）累積實驗進行檢測，并利用特異性抑制劑（PSC833抑制ABCB1，MK-571抑制ABCC1）來區(qū)分不同轉(zhuǎn)運蛋白亞型的活性，檢測同樣依托流式細胞術(shù)完成。
研究結(jié)果
3.1. 體腔細胞類型
通過形態(tài)學(xué)分析，研究者在五孔餅海膽中鑒定出四種主要的體腔細胞類型：吞噬細胞（phagocytes）、大球形顆粒細胞（large spherical corpuscles）、小球形細胞（spherulocytes，包括無色、黃褐色和紅色三種亞型）以及梭形細胞（fusiform cells）。此外，文中還觀察到一種在文獻中常于海參中報道的“晶體細胞”（crystal cell）樣結(jié)構(gòu)，但這些結(jié)構(gòu)未被核酸或線粒體染料著色，因此不被認為是真正的細胞，推測可能是生物礦化殘留物或鹽類晶體。值得注意的是，在規(guī)則海膽中常見的顫動細胞（vibratile cells）在本研究中并未發(fā)現(xiàn)。
3.1.1. 吞噬細胞
吞噬細胞是形態(tài)和大小最多樣化的細胞類型。根據(jù)細胞周長，可分為大周長（>50 μm）和小周長（<50 μm）兩類；根據(jù)形狀，又可細分為絲足型（filopodial）和多邊型（polygonal）。所有吞噬細胞均含有囊泡內(nèi)含物和顏色各異的細胞質(zhì)顆粒。
3.1.2. 大球形顆粒細胞
此類細胞具有顯著的內(nèi)質(zhì)，平均直徑為32.26 ± 8.28 μm，細胞核清晰可見。其囊泡區(qū)室顏色從無色到粉紅色或紅色不等，內(nèi)含可進行布朗運動的小顆粒。
3.1.3. 小球形細胞
根據(jù)胞內(nèi)囊泡顏色分為無色、黃褐色和紅色三個亞型。在抗凝溶液中它們呈球形，但其典型運動形態(tài)為阿米巴樣。細胞直徑在15.64 ± 3.45 μm（黃褐色）到18.86 ± 5.42 μm（無色）之間。
3.1.4. 梭形細胞
這是體積最小的細胞類型（細胞周長34.02 ± 11.50 μm），呈特征性的紡錘形，具有單一或分叉的絲足樣結(jié)構(gòu)。
3.2. 體腔細胞總數(shù)與分類計數(shù)
五孔餅海膽體腔細胞的總平均濃度為1.19 x 107± 5.01 x 106個細胞/mL。吞噬細胞是最豐富的類型，占總數(shù)的81.12% ± 6.16%，濃度達9.65 x 106± 4.13 個細胞/mL。梭形細胞最為罕見，僅占1.07% ± 0.67%。
3.3. 吞噬作用
平均總吞噬率為20.44% ± 9.70%，其中12.24% ± 5.32%的細胞吞噬了一個微球，8.20% ± 3.13%的細胞吞噬了兩個及以上微球。熒光與共聚焦顯微鏡觀察證實，吞噬細胞是唯一能夠內(nèi)化乳膠微球的細胞類型。
3.4. ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性
使用ABCC1轉(zhuǎn)運蛋白特異性抑制劑MK-571預(yù)處理后，細胞內(nèi)的鈣黃綠素?zé)晒鈴姸戎形粩?shù)增加了2.75倍，表明存在活躍的ABCC1同源轉(zhuǎn)運蛋白活性。而使用ABCB1抑制劑PSC833預(yù)處理則未引起鈣黃綠素積累的顯著變化，提示該物種體腔細胞中ABCB1同源轉(zhuǎn)運蛋白活性很低或不存在。
研究結(jié)論與討論
本研究系統(tǒng)描繪了熱帶餅海膽五孔餅海膽的免疫細胞譜系，填補了不規(guī)則海膽（特別是餅海膽科）免疫學(xué)研究的空白。研究確認了四種體腔細胞類型，其組成既包含與規(guī)則海膽共享的保守類型（如吞噬細胞、小球形細胞），也包含可能為該類群特有的類型（如大球形顆粒細胞），同時缺乏規(guī)則海膽中常見的顫動細胞。這提示餅海膽的免疫系統(tǒng)在進化中既有繼承，也可能發(fā)生了適應(yīng)其扁平形體與沙棲生態(tài)的獨特分化。
功能研究表明，吞噬細胞不僅是數(shù)量上的絕對主力，也是執(zhí)行吞噬功能的唯一細胞類型，其平均吞噬能力（約20%）與其他一些棘皮動物相近，但低于部分海膽物種。這種高細胞豐度與相對中等吞噬活性的組合，可能反映了細胞處于不同的激活狀態(tài)，或受到其他體腔細胞通過分泌細胞因子等可溶性因子進行的協(xié)同調(diào)控。這與先天性免疫系統(tǒng)中細胞間通訊至關(guān)重要的觀點相符。
在分子防御機制層面，研究首次在餅海膽體腔細胞中證實了ABCC1同源轉(zhuǎn)運蛋白的活性，但未檢測到明顯的ABCB1活性。這種ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性譜的物種間差異，可能與其免疫能力或?qū)μ囟ㄍ庠?內(nèi)源物質(zhì)的抵抗策略有關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白不僅在多藥耐藥（MDR）和多異生生物耐藥（MXR）中起作用，也參與免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和細胞遷移等過程，因此其活性模式也是理解物種免疫生理和 environmental stress（環(huán)境脅迫）響應(yīng)的關(guān)鍵窗口。
綜上所述，這項工作不僅增進了我們對棘皮動物門內(nèi)免疫系統(tǒng)多樣性的認識，揭示了規(guī)則與不規(guī)則海膽之間免疫細胞的異同，也為將五孔餅海膽開發(fā)成為一種有效的環(huán)境生物指示劑奠定了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。其廣泛的地理分布、底棲習(xí)性以及對環(huán)境脅迫的潛在可測反應(yīng)（通過體腔細胞類型比例、吞噬活性或ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性等指標(biāo)），使得監(jiān)測其免疫狀態(tài)成為評估熱帶沿海生態(tài)系統(tǒng)健康的一個 promising（有前景的）新工具。未來研究可以進一步探索不同體腔細胞類型在應(yīng)對病原體或污染物時的具體協(xié)作機制，以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白在餅海膽免疫與環(huán)境適應(yīng)中的精確功能。
