《European Journal of Cell Biology》：TGF-β Drives Pulmonary Fibrosis Through Dual Dysregulation of TNF Pathway Transcription and Splicing
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盡管已知TGF-β信號是肺纖維化（PF）進展的關鍵驅動者，但其如何通過調控下游轉錄和選擇性剪接（AS）來推進疾病仍不甚明了。本研究在TGF-β誘導的原代小鼠成纖維細胞纖維化模型中，結合RNA-seq、CUT&Tag和Iso-seq技術，系統性地回答了這一問題。研究發現TNF信號通路是纖維化的核心驅動者，SMAD3通過上調轉錄因子ISL1抑制下游效應基因VCAM1，同時TGF-β刺激導致全基因組AS復雜性降低，尤其是在TNF通路基因（如Vcam1、Vegfd）中。這種TNF信號在轉錄和剪接水平的雙重失調共同抑制了成纖維細胞凋亡，加劇了纖維化進程。該研究揭示了TGF-β/SMAD信號通過協同調控轉錄組和剪接組驅動肺纖維化的獨特機制，為理解疾病發生和尋找新治療靶點提供了重要見解。
肺，一個看似簡單的呼吸器官，卻在悄無聲息中可能被一種名為肺纖維化（Pulmonary Fibrosis, PF）的慢性疾病所侵蝕。想象一下，肺部原本柔軟、充滿彈性的肺泡結構，逐漸被堅硬的疤痕組織所替代，就像皮膚受傷后留下的傷疤，這個過程會嚴重影響肺部的氣體交換能力，導致患者呼吸困難、生活質量嚴重下降，甚至最終走向呼吸衰竭。盡管已有吡非尼酮和尼達尼布等抗纖維化藥物應用于臨床，但它們的療效有限且副作用明顯，因此，深入探究肺纖維化背后的“罪魁禍首”和作案細節，是科學界迫在眉睫的任務。
在這一病理過程中，轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β）及其下游的SMAD信號通路被公認為是驅動纖維化的“核心指揮官”。它就像一名總指揮，能夠“命令”肺部成纖維細胞活化、轉變為更具攻擊性的肌成纖維細胞，并過量生產膠原蛋白等細胞外基質（Extracellular Matrix, ECM），最終導致肺部結構僵硬。然而，這位“指揮官”具體是通過調控哪些“關鍵下屬”（下游靶基因）來發號施令的？除了改變基因的“產量”（表達水平），它是否還會篡改基因的“生產圖紙”（選擇性剪接，Alternative Splicing, AS），從而制造出功能異常的蛋白質，最終推動疾病發展？這些問題，正是本項研究試圖揭開的謎團。
為了更貼近真實的人體情況，研究人員沒有使用易于培養但可能失真的永生化細胞系，而是精心地從小鼠肺組織中分離出了原代肺成纖維細胞，并用TGF-β進行刺激，成功構建了一個體外肺纖維化模型。這個模型再現了纖維化的關鍵特征：活化的SMAD3蛋白（p-SMAD3）增多，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和骨橋蛋白（OPN）等纖維化標志物表達上調。研究人員就像一個偵探團隊，運用了多種高科技“偵查工具”來全面分析這個模型：用RNA測序（RNA-seq）繪制基因表達的全局變化圖譜；用CUT&Tag技術精確定位激活的SMAD3蛋白在基因組上的“落腳點”；用全長轉錄本測序（Iso-seq）技術，像高清攝像機一樣，無偏差地捕捉所有基因轉錄本的全貌，精準識別選擇性剪接事件。
主要技術方法包括：從小鼠肺組織分離和培養原代成纖維細胞，并使用TGF-β1刺激建立體外纖維化模型。通過RNA-seq對正常組織和纖維化細胞的轉錄組進行測序和差異分析。利用CUT&Tag技術，結合抗p-SMAD3抗體，在全基因組范圍內繪制SMAD3蛋白的染色質結合圖譜。采用PacBio平臺的Iso-seq（全長轉錄本測序）技術，無偏好性地鑒定和比較正常與纖維化細胞中的全轉錄本結構與選擇性剪接事件。通過定量PCR、Western blot、半定量RT-PCR和siRNA基因敲低等分子生物學實驗對組學分析發現的關鍵分子和通路進行功能驗證。
3.1. 利用TGF-β刺激的原代小鼠肺成纖維細胞建立肺纖維化體外模型
研究人員成功建立了模型，驗證了細胞具有成纖維細胞特征（VIMENTIN和COL1A1陽性），并證實TGF-β刺激后，纖維化標志物（α-SMA, OPN, Col1a1, Acta2）表達上調，SMAD3被磷酸化激活，SMAD通路組分（Smad2, Smad4, Smad6, Smad7）表達也發生改變，同時膠原代謝和活性氧水平升高，綜合表明纖維化模型構建成功。
3.2. Isl1是TGF-β誘導的肺纖維化中的主要轉錄調控因子
RNA-seq分析發現，在TGF-β誘導的原代和NIH3T3成纖維細胞中，差異表達基因（DEGs）均顯著富集于TNF信號通路，提示該通路是纖維化的保守驅動者。通過交叉數據庫分析，鑒定出五個表達改變的轉錄因子，其中ISL1能調控16%的TGF-β應答差異表達基因，包括TNF通路的關鍵效應基因Vcam1。在纖維化細胞中，Isl1表達上調，而其潛在靶基因Vcam1表達下調，提示ISL1可能作為TGF-β應答的主調控因子，通過抑制Vcam1等基因促進纖維化。
3.3. TGF-β誘導的P-SMAD3激活增強其與染色質的結合并調控Isl1表達
CUT&Tag-seq分析顯示，在纖維化細胞中，p-SMAD3在基因組上的結合位點數量倍增，且這些新獲得的結合位點顯著富集SMAD結合基序。整合分析發現84個基因同時受p-SMAD3結合且表達改變，其中包括轉錄因子Isl1。這表明激活的SMAD3能直接結合到Isl1的啟動子區域，驅動其轉錄上調，從而將TGF-β信號與ISL1聯系起來。
3.4. Iso-seq數據揭示纖維化原代成纖維細胞中存在大規模選擇性剪接變化
Iso-seq分析顯示，與正常細胞相比，纖維化細胞發生了全基因組范圍內的選擇性剪接事件數量顯著減少，剪接模式復雜性降低，表現為能產生多類剪接事件或多種轉錄本異構體的基因數量下降。功能富集分析表明，發生差異剪接的基因與細胞周期、增殖等通路相關。特別值得注意的是，在纖維化細胞中，選擇性剪接基因顯著富集于TNF信號通路。
3.5. Iso-seq發現了二代測序未檢測到的獨特選擇性剪接事件
比較Iso-seq和RNA-seq數據發現，Iso-seq能檢測到更多、更全面的選擇性剪接事件和基因。其中，僅被Iso-seq檢測到的差異剪接基因（即RNA-seq漏檢的）顯著富集于TNF信號通路、TGF-β信號通路等關鍵通路。這凸顯了Iso-seq技術在發現復雜剪接變化，特別是與疾病相關通路剪接失調方面的獨特優勢。
3.6. TNF通路失調抑制肺纖維化中的細胞凋亡
研究人員聚焦于TNF通路中發生顯著剪接變化的效應基因Vcam1和Vegfd。Iso-seq和半定量PCR證實，在纖維化細胞中，Vcam1的轉錄本異構體多樣性大幅減少，其第3外顯子（編碼一個重要的免疫球蛋白樣結構域）的包含率顯著降低。功能上，纖維化細胞表現出明顯的抗凋亡表型：促凋亡因子BAX、CASPASE-9、CASPASE-3的表達和活化形式減少，而抗凋亡因子BCL-2表達增加。這表明TNF通路在轉錄和剪接水平的失調共同導致了成纖維細胞的凋亡抵抗。
3.7. Isl1-Vcam1軸是纖維化成纖維細胞凋亡抵抗所必需的
功能實驗證實了SMAD3-ISL1-VCAM1調控軸的存在及其功能重要性。在纖維化細胞中敲低Isl1，能夠逆轉Vcam1的表達抑制，并同時將凋亡相關基因的表達模式向促凋亡方向轉變。相反，直接敲低Vcam1則會增強細胞的抗凋亡表型。這些結果證明，TGF-β/SMAD3通過上調ISL1來抑制VCAM1的表達，是維持纖維化成纖維細胞凋亡抵抗狀態的關鍵機制。
結論與意義
本研究系統性地揭示了TGF-β/SMAD信號通路驅動肺纖維化的一個新穎而協調的雙重機制。研究發現，TNF信號通路是不同成纖維細胞模型中保守的纖維化驅動通路。在機制上，激活的SMAD3直接結合并上調轉錄因子ISL1的表達，而ISL1進而抑制了TNF通路關鍵效應分子VCAM1的轉錄。與此同時，TGF-β刺激引發了全基因組水平的選擇性剪接復雜性降低，呈現出從“復雜模式”向“簡單模式”的轉變，其中TNF通路基因（如Vcam1和Vegfd）的剪接多樣性喪失尤為顯著。這種在轉錄水平和轉錄后剪接水平上對TNF通路（特別是Vcam1）的雙重失調，共同削弱了細胞的正常凋亡程序，導致成纖維細胞獲得凋亡抵抗能力，從而持續存活并過度分泌細胞外基質，最終加劇肺纖維化的病理進程。
這項發表于《European Journal of Cell Biology》的研究具有多重重要意義。首先，它超越了TGF-β調控ECM相關基因的傳統認知，將其作用范圍擴展至協調轉錄組和剪接組，并精細調控如VCAM1這類涉及免疫細胞粘附和血管炎癥的分子。其次，研究強調了在纖維化背景下，選擇性剪接的全局性重編程是一個此前被低估的重要病理層面對此，高分辨率的Iso-seq技術發揮了不可替代的作用。最后，研究鑒定出的SMAD3-ISL1-VCAM1信號軸以及TNF通路的雙重失調，為肺纖維化的治療提供了新的潛在干預靶點。針對該軸上的關鍵節點（如ISL1或VCAM1的剪接調控）進行干預，可能有助于恢復成纖維細胞的正常凋亡敏感性，從而為開發更有效的抗肺纖維化策略開辟了新途徑。
