《Experimental Cell Research》：Reprogramming of astrocytes into motoneuron-like cells by a Ascl1-Myt1l-Pou3f2-Isl1 cocktail
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脊髓損傷修復中星形膠質細胞重編程為運動神經元樣細胞的研究發現4F雞尾酒（Ascl1-Myt1l-Pou3f2-Isl1）能誘導大鼠和人類反應性星形膠質細胞向運動神經元樣細胞分化，其標志物表達及功能特性驗證了重編程的有效性。
楊瑞云|沈建宏|金鵬杰|姚琪|陳思穎|吳天琪|常素妍|潘靜穎|陳穎|陳剛
中國江蘇省南通市南通大學醫學院組織胚胎學系，郵編226001
摘要
將脊髓星形膠質細胞重編程為運動神經元在脊髓損傷的再生醫學中具有巨大潛力。我們發現了一組四種轉錄因子——無毛-盾狀復合體同源物1、髓鞘轉錄因子1類似物、POU類3同源框2和ISL LIM同源框1，這些因子統稱為4F混合物。4F混合物能夠將大鼠和人類的反應性星形膠質細胞重編程為類似運動神經元的細胞。這些重編程后的細胞表現出神經元形態，并且對微管相關蛋白2（MAP2，一種神經元特異性標記物）和膽堿乙酰轉移酶（一種已知的運動神經元特異性標記物）呈陽性反應。在4F混合物介導的星形膠質細胞重編程早期，定量實時逆轉錄聚合酶鏈反應顯示星形膠質細胞基因膠質纖維酸性蛋白的表達受到抑制。此外，在5天內，神經前體細胞標記物SRY-box轉錄因子2和神經細胞粘附分子1的表達上調，而在7天內，運動神經元前體標記物少突膠質細胞轉錄因子2被激活。進一步研究表明，使用4F混合物誘導后，重編程細胞中神經基因Map2、突觸素I、微管β-3和神經絲重鏈的表達增加，同時運動神經元基因ISL LIM同源框1、運動神經元和胰腺同源框1、LIM同源框3以及NK6同源框1的表達也增加，運動神經元的存活率也有所提高。更重要的是，4F混合物重編程后的類似運動神經元的細胞能夠釋放乙酰膽堿，并對谷氨酸誘導的興奮毒性表現出敏感性。我們的研究結果表明，4F混合物首先將脊髓星形膠質細胞重編程為類似神經前體細胞和運動神經元前體細胞的中間可塑狀態，然后進一步發育為類似運動神經元的細胞。
引言
脊髓損傷（SCI）會損害并破壞脊髓中的神經元，導致運動和感覺功能受損，隨后引發炎癥和瘢痕形成[1]、[2]、[3]。SCI影響全球許多人[4]、[5]。然而，成人的脊髓無法生成新的神經元，這使得SCI的治療變得非常困難。因此，找到有效補充神經元（尤其是運動神經元）的策略是治療SCI的關鍵步驟[6]、[7]。
研究人員已經使用干細胞療法來應對SCI導致的神經元大量損失問題，但免疫反應和倫理問題使得干細胞技術的發展面臨挑戰[8]。最近，體細胞重編程技術引起了科學家的關注。重編程技術是指通過生物技術將來自豐富且易于獲取的體細胞直接轉化為神經元和其他目標細胞。研究發現，某些轉錄因子在誘導體細胞向神經元轉化方面具有巨大潛力[9]、[10]。無毛-盾狀復合體同源物1（Ascl1）在神經元分化和神經發生中起著關鍵作用[11]。作為先導因子，Ascl1啟動了神經元重編程過程[12]。研究表明，Ascl1可以在體外和體內將背側中腦星形膠質細胞重編程為神經元[13]。與激活因子Ascl1不同，髓鞘轉錄因子1類似物（Myt1l）則抑制許多非神經元類型的細胞分化[14]。Ascl1和Myt1l相互補充，共同決定神經元的命運。此外，POU類3同源框2（Pou3f2）轉錄因子在神經元分化中也非常重要[15]。在體外條件下，通過過表達Pou3f2可以將皮質星形膠質細胞轉化為功能性神經元和神經前體細胞（NPCs）[16]。此外，通過結合使用Ascl1、Myt1l和Pou3f2，可以在體外將成纖維細胞重編程為神經元[17]。ISL LIM同源框1（Isl1）與神經發生素2（Ngn2）、SRY-box轉錄因子11（Sox11）和LIM同源框3（Lhx3）一起使用，可以直接在體外將人類成纖維細胞重編程為運動神經元[18]。然而，目前尚無關于這四種轉錄因子（Ascl1-Myt1l-Pou3f2-Isl1，即4F混合物）對星形膠質細胞重編程聯合效應的研究。因此，需要進一步的研究來探索這種組合的潛力。
在脊髓中，星形膠質細胞數量豐富，積極參與維持穩態和調節神經回路活動。然而，在損傷后，星形膠質細胞的增殖以及損傷部位瘢痕組織的形成成為阻礙軸突再生和功能恢復的主要障礙[19]、[20]。運動神經元的主要功能是控制肌肉運動。運動神經元是一種獨特的神經元亞型，這些細胞的退化或喪失是SCI的特征[21]。因此，補充運動神經元可能有助于SCI模型動物的運動功能恢復[7]、[18]。因此，關鍵在于找到促進受損脊髓中神經元再生和功能恢復的有效策略。重編程后的細胞可以用于SCI的治療[22]、[23]、[24]。一種有前景的方法是將星形膠質細胞重編程為運動神經元，用于SCI的細胞移植治療。在本研究中，我們假設稱為4F混合物的一組因子可能在星形膠質細胞的重編程中發揮積極作用；因此，我們旨在探索4F混合物在誘導類似運動神經元細胞方面的潛力。
我們成功發現，在我們建立的體外模型中，同時表達4F混合物足以將大鼠和人類的反應性脊髓星形膠質細胞轉化為類似運動神經元的細胞（見圖1）。這一發現對于SCI的修復具有重大意義，因為這些由4F混合物誘導的星形膠質細胞衍生的運動神經元可以移植到SCI模型中。此外，我們的研究表明，受傷脊髓中的駐留星形膠質細胞可能通過特定的因子組合被重編程為運動神經元。這一發現為利用星形膠質細胞衍生的運動神經元進行原位修復SCI提供了新的可能性�？傮w而言，我們的研究為SCI的修復提供了新的策略和理論基礎。
部分內容摘錄
病毒載體構建
為了構建慢病毒載體，將大鼠的Ascl1、Myt1l、Pou3f2和Isl1基因亞克隆并插入pLenti-Gfap-EGFP-CMV-MCS載體（OBiO Biotechnologies）中。將人類的ASCL1、MYT1L、POU3F2和ISL1基因亞克隆并插入pLenti-GFAP-EGFP-CMV-MCS載體（OBiO Biotechnologies）中。這些基因的表達由膠質纖維酸性蛋白（GFAP）啟動子控制[7]。該慢病毒載體編碼增強了綠色熒光蛋白（EGFP）[25]。
原代大鼠脊髓星形膠質細胞的激活
我們使用原代脊髓星形膠質細胞進行4F混合物重編程實驗。為了模擬SCI后體外觀察到的反應性星形膠質細胞的特征，我們使用LPS激活原代大鼠脊髓星形膠質細胞。24小時后，對照組和LPS處理的星形膠質細胞都表達了GFAP，這是星形膠質細胞的經典標記物。LPS處理的星形膠質細胞表現出GFAP強度增加和肥大形態（圖2A）。同時，Gfap mRNA的表達顯著上調
討論
運動神經元主要存在于脊髓中，它們的退化或喪失是SCI的特征[34]、[35]、[36]。研究表明，補充運動神經元對促進SCI后的功能恢復具有顯著的治療效果[7]、[35]。在SCI發生后，多種類型的細胞會被激活，包括星形膠質細胞、NG2-膠質細胞、室管膜細胞、周細胞、小膠質細胞和成纖維細胞，這些細胞會增殖、遷移，并在損傷部位及其周圍形成纖維膠質瘢痕
CRediT作者貢獻聲明
陳剛：概念設計。陳穎：寫作 – 審稿與編輯。潘靜穎：寫作 – 審稿與編輯。常素妍：監督。吳天琪：監督。陳思穎：監督。姚琪：實驗研究。金鵬杰：實驗研究。沈建宏：軟件與數據管理。楊瑞云：寫作 – 初稿撰寫，方法學設計
利益沖突
作者聲明本研究是在沒有任何可能被視為潛在利益沖突的商業或財務關系的情況下進行的。
利益沖突聲明
作者聲明本研究是在沒有任何可能被視為潛在利益沖突的商業或財務關系的情況下進行的。
致謝
我們感謝國家自然科學基金（編號82101455、31872773、81971763）、江蘇省高等教育機構優先學術發展計劃（PAPD）、南通市第十四個五年科學、教育與健康項目（NTCXTD48）以及南通市市民科學技術項目（MS2023045）和江蘇省高校大學生實踐創新培訓項目（202410304124Y）的支持。
