《Nature Methods》：Next-generation multicolor indicators for in vivo imaging of norepinephrine
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本期《Nature Methods》推薦一項神經科學前沿工具研究。針對現有遺傳編碼去甲腎上腺素(NE)熒光傳感器靈敏度與光譜靈活性不足的問題，研究團隊成功開發了新一代綠色與紅色熒光NE傳感器nLightG2和nLightR2。這兩種傳感器顯著提升了對內源性NE釋放的檢測能力，支持在清醒行為小鼠中進行雙色光纖光度記錄和雙光子成像，實現了NE信號與神經元或星形膠質細胞活動的同時監測，為解析大腦NE信號傳遞的時空復雜性提供了強大工具箱。
去甲腎上腺素（Norepinephrine, NE）是大腦中一種至關重要的神經調質，它像一位繁忙的信使，動態地塑造著我們的覺醒、感覺處理、記憶形成、壓力反應等一系列高級認知功能和大腦狀態。然而，想要實時、精確地“看到”這種信使在大腦中何時、何地、以何種方式釋放，并理解其如何與復雜的神經環路活動相互配合，一直是神經科學家面臨的一大技術挑戰。傳統的檢測方法，如快速掃描循環伏安法、微透析等，各有局限，或缺乏時空分辨率，或缺乏特異性。盡管基于G蛋白偶聯受體（GPCR）的基因編碼熒光傳感器（GEFIs）的出現帶來了革命，使得在體高分辨率可視化NE釋放成為可能，但現有傳感器的靈敏度，尤其是紅色熒光傳感器的性能，仍限制了它們在復雜實驗范式中的廣泛應用。這就好比我們雖然有了一副能“看到”神經信號的眼鏡，但鏡片還不夠清晰，顏色也不夠豐富，難以同時觀察多個目標。那么，能否制造出更亮、更靈敏、色彩更齊全的“眼鏡”，來更清晰地描繪NE在大腦中的動態圖譜呢？
為了回答這個問題，一支國際研究團隊在《Nature Methods》上報道了他們開發的新一代綠色和紅色熒光NE傳感器，分別命名為nLightG2和nLightR2。他們通過系統性的工程改造和優化，顯著提升了這些傳感器的性能，并將其應用于多種在體成像場景，成功揭示了NE信號傳遞的精細時空動態。這項研究主要運用了分子克隆與點突變篩選、細胞水平（HEK293T細胞和原代神經元）功能表征、離體腦片雙光子成像、在體光纖光度記錄（包括單色和雙色記錄）、在體雙光子顯微鏡成像以及虛擬現實行為學范式等關鍵技術方法。研究使用了小鼠模型，并通過立體定位注射重組腺相關病毒（rAAV）在特定腦區表達傳感器。
研究結果
新一代nLight傳感器的開發
研究人員從先前報道的紅色和綠色多巴胺傳感器RdLight1和dLight1.3b的改良版本中獲得靈感，通過引入特定的點突變和對受體C末端的截短，成功改造了基于抹香鯨α1A腎上腺素能受體（swA1AAR）的NE傳感器。由此得到的新傳感器nLightR2和nLightG2，在HEK293T細胞和原代皮質神經元中均顯示出比前代傳感器（nLightR和nLightG）顯著增強的亮度和動態范圍。例如，nLightR2的動態范圍提升了約3.7倍，而nLightG2的動態范圍更是達到了同類傳感器中極高的水平。研究還證實了傳感器對NE的高度選擇性、可逆的激活/失活動力學（亞秒級）、對pH變化的不敏感性，以及關鍵的一點：這些工程化的傳感器與下游G蛋白和β-arrestin2的偶聯能力被極大削弱，這意味著它們主要作為“旁觀者”報告NE濃度，而不會顯著干擾細胞固有的NE信號通路。
離體腦片中的性能基準測試
在急性腦切片中，使用雙光子顯微鏡和離子電泳施加NE或電刺激誘發內源性NE釋放，研究人員直接比較了新老傳感器的性能。結果表明，無論是在檢測外源性還是內源性NE時，nLightR2和nLightG2產生的熒光信號幅度和可檢測的信號空間范圍都顯著優于其前代傳感器，證明了它們在組織環境中具有更高的靈敏度。
在體性能驗證
在活體小鼠中，研究團隊通過多種行為范式驗證了新一代傳感器的卓越性能。在恐懼條件化任務中，記錄基底外側杏仁核（BLA）的NE釋放，發現nLightG2檢測到的聲音線索（條件刺激，CS）和足底電擊（非條件刺激，US）所誘發的NE信號峰值均顯著高于nLightG和另一款常用傳感器GRABNE2m。通過光遺傳學激活藍斑（LC）到背側海馬（dHPC）的通路，nLightR2能夠可靠地報告出光誘發的NE釋放，而其前代nLightR和突變對照傳感器（nLightR2-ctr）則無法做到，這凸顯了nLightR2在體檢測靈敏度的實質性飛躍。
在體多路檢測NE與神經活動
研究展示了新傳感器用于多參數測量的強大能力。在睡眠研究中，通過在LC神經元中共表達紅色鈣傳感器jGCaMP8f和nLightR2，并進行雙色光纖記錄，發現nLightR2信號能夠以極高的時間保真度跟隨LC神經元自身的鈣活動波動，清晰報告出非快速眼動睡眠期間LC的周期性活動峰所導致的NE釋放。在恐懼學習中，通過在杏仁核共表達綠色NE傳感器nLightG2和紅色鈣傳感器PinkyCaMP，實現了對局部神經元鈣活動與NE釋放的同時監測。結果發現，在記憶形成后，聲音線索不僅能引發更強的神經元鈣反應，也伴隨著更顯著和持續的NE釋放增加，而對照傳感器則無此變化，清晰揭示了學習過程中NE信號與神經元活動的共變關系。
NE與星形膠質細胞鈣活動的多色雙光子成像
利用nLightR2的紅色熒光特性，研究人員首次實現了在體、同時、雙色雙光子成像，分別監測海馬CA1區神經元表達的nLightR2（報告細胞外NE）和星形膠質細胞特異表達的GCaMP6f（報告細胞內鈣）。在虛擬導航任務中，他們發現NE信號的釋放與小鼠的運動起始和獎勵獲取等行為事件相關。更重要的是，他們首次在單細胞空間分辨率上觀察到，獎勵事件后，鄰近位置的NE信號與星形膠質細胞的鈣活動之間存在顯著的相關性，且這種相關性具有行為依賴性。這為研究NE如何通過調節膠質細胞來影響神經環路功能提供了全新的視角。
研究結論與意義
本研究成功開發并全面驗證了新一代綠色和紅色熒光去甲腎上腺素傳感器nLightG2和nLightR2。它們克服了前代工具在靈敏度、亮度特別是紅色傳感器性能方面的關鍵限制，成為了在體監測NE動態的強大工具。通過光纖光度法和雙光子成像，研究不僅證明了新傳感器在檢測生理性、行為相關的NE釋放方面具有卓越性能，還開創性地實現了NE信號與神經元活動、星形膠質細胞鈣動態的同時、多色成像。這項工作所提供的改進工具包，將極大地推動未來研究去解析NE信號在大腦中的復雜時空動力學，及其在睡眠-覺醒調節、學習記憶、情緒處理等多種腦功能與疾病狀態中的精確作用機制。這些傳感器有望成為神經科學領域探索神經調質世界的“高清晰度多色眼鏡”，揭開大腦化學信號傳遞的更多奧秘。
