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谷胱甘肽（GSH）是酵母中重要的抗氧化劑，本研究通過ARTP誘變結合全基因組測序，發現SEM1基因（編碼26S蛋白酶體亞基）的突變可顯著提升GSH產量，機制與ATP水平升高相關。
嚴志波|賴曉寧|劉勇|趙新晴|秦玲|黃明濤
華南理工大學食品科學與工程學院，中國廣州510641
摘要
谷胱甘肽（GSH）是生物體內最豐富的非蛋白質硫醇，廣泛應用于食品、制藥和化妝品行業。雖然基于酵母的GSH生產技術已經成熟，但優化菌株性能和提高生產效率仍是當前研究的熱點。在本研究中，我們結合了常壓和室溫等離子體（ARTP）誘變技術以及全基因組測序方法，以鑒定能夠增強Saccharomyces cerevisiae中GSH生物合成的新遺傳靶點。研究發現，某些先前未被表征的突變在不同程度上提高了GSH的產生量。其中，編碼26S蛋白酶體亞基的SEM1基因發生突變后，GSH產量顯著增加，其完全缺失使產量比對照組提高了35.5%。機制分析表明，SEM1的功能喪失顯著提升了細胞內ATP的水平，而ATP是GSH生物合成過程中的關鍵輔因子。這些發現揭示了蛋白酶體相關ATP消耗與GSH合成之間的新關聯，為理解酵母中代謝物生物合成的能量耦合調控機制提供了新的見解。
引言
谷胱甘肽（γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，GSH）是一種由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。它是生物體內最豐富的低分子量非蛋白質硫醇，在維持細胞氧化還原平衡中起著核心作用（Kobayashi等人，2022年）。作為主要的細胞內抗氧化劑，GSH通過清除活性氧（ROS）來保護細胞免受氧化應激（Guan，2023年）。此外，GSH還參與外源物質解毒和免疫調節等生理過程（Gasmi等人，2024年）。由于其多功能性，GSH在食品、制藥和化妝品行業具有廣泛的應用。
隨著商業需求的增加（Santos等人，2022年），提高GSH的生產效率成為當務之急。目前已探索了多種生產方法，包括溶劑提取、化學合成和微生物發酵（Chen等人，2020a年）。然而，前兩種方法存在生產成本高、產量低和環境影響等問題，限制了其工業應用。相比之下，基于微生物的發酵方法更為可持續且可擴展。在微生物平臺中，Saccharomyces cerevisiae因其生長迅速、遺傳操作簡便及安全性良好而成為生產GSH的首選宿主。值得注意的是，S. cerevisiae能自然積累高濃度的GSH，其含量可達干重（DCW）的0.1–1.0%（Penninckx，2002年），使其成為工業規模生物合成的理想選擇。
隨著GSH生物合成途徑的闡明（Li等人，2004年），基于酵母的GSH發酵研究開始興起。早期研究主要集中在優化發酵條件以增加細胞內GSH含量和生物量，從而提高總產量（Cha等人，2004年；Chen等人，2009年；Rollini & Manzoni，2006年；Santos等人，2007年；Wen等人，2006年）。然而，近年來代謝工程和合成生物學的進展使得人們開始關注菌株改良。許多研究表明，通過基因工程改造的S. cerevisiae菌株能夠提高GSH產量（Jeon等人，2023年；Kobayashi等人，2019年；Kobayashi等人，2022年；Prima等人，2017年；Tang等人，2015年）。盡管取得了進展，實現高產GSH仍面臨挑戰。理性工程主要局限于已知生物合成途徑的修改，許多重要的遺傳或調控因素尚未被探索。鑒于GSH參與多種細胞過程，其合成與更廣泛的代謝網絡密切相關。這種復雜性表明，在S. cerevisiae中可能存在未被發現的基因靶點或調控模塊，這些因素可能影響GSH的合成，但在以途徑為中心的工程框架中往往被忽視。我們將這些間接或輔助的遺傳因素稱為“分支途徑”，強調它們在核心生物合成途徑之外的潛在作用。然而，迄今為止對這些分支途徑的系統研究仍十分有限。
在本研究中，我們首先使用ARTP誘變技術提高酵母的GSH產量，隨后通過全基因組測序鑒定由ARTP引入的突變，并通過反向代謝工程和發酵實驗評估候選靶點的功能相關性，從而揭示了促進GSH生物合成的分支途徑（圖1）。通過這種方法，我們發現了一些與GSH合成密切相關的非傳統基因。其中，26S蛋白酶體復合體的組分SEM1被證實是關鍵因素。SEM1突變株的細胞內ATP水平升高，表明26S蛋白酶體介導的泛素依賴性蛋白水解可能通過重新分配能量資源來促進GSH合成。本研究提出了一種通過鑒定新遺傳靶點來調節酵母GSH合成的實用策略，為開發高效生產高能耗化合物的酵母細胞工廠提供了重要啟示。
兩種親本酵母菌株的比較
本研究旨在鑒定S. cerevisiae中影響GSH生物合成的未知基因靶點和調控元件。目前相關的全基因組研究還較為有限。為高效完成這一任務，我們使用了兩種不同的S. cerevisiae菌株C113-5D和C1447，并分別對其進行多輪ARTP誘變。這種迭代進化策略旨在逐步產生具有改良特性的突變菌株系。
結論
本研究發現了影響S. cerevisiae中GSH生物合成的新遺傳靶點。通過迭代ARTP誘變，我們獲得了GSH產量逐步提高的酵母變體，并通過全基因組測序鑒定了進化過程中累積的突變。反向工程和發酵分析驗證了多個增強GSH合成的新遺傳靶點，其中26S蛋白酶體亞基SEM1尤為關鍵。
CRediT作者貢獻聲明
賴曉寧：撰寫初稿、實驗設計、方法學研究、數據分析、概念構建。嚴志波：撰寫初稿、方法學研究、數據分析、概念構建。黃明濤：撰寫修訂稿、項目監督、數據分析、概念構建。秦玲：撰寫修訂稿、數據分析、數據整理、概念構建。趙新晴：撰寫修訂稿、數據分析。劉勇：實驗研究
利益沖突聲明
M.H.、Z.Y.和L.Q.已申請專利以保護與本研究相關的酵母菌株及其應用。若存在其他作者，他們聲明沒有可能影響本文研究結果的已知財務利益或個人關系。
利益沖突聲明
作者聲明以下可能構成利益沖突的財務利益或個人關系：M.H.、Z.Y.和L.Q.已申請專利以保護與本研究相關的酵母菌株及其應用。若存在其他作者，他們聲明沒有可能影響本文研究結果的已知財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了
國家自然科學基金（32471482）、
中央高校基本科研業務費（2024ZYGXZR015）以及中國廣州市科技計劃（2024A04J3562）的支持。圖形摘要和圖1由
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