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        一種基于無標簽G-四鏈結構的比色和熒光適配體傳感器,用于準確檢測單核細胞增生李斯特菌(Listeria Monocytogenes)

        《Food Bioscience》:A label-free G-quadruplex based colorimetric and fluorescent aptasensor for accurate detection of Listeria Monocytogenes

        【字體: 時間:2026年02月28日 來源:Food Bioscience 5.9

        編輯推薦:

          李斯特菌快速檢測方法:基于ZIF-90載體的無標記G-四聯體aptasensor實現顏色/熒光雙重信號,檢測限10 CFU/mL,線性范圍廣,在牛奶和生菜中驗證回收率94.4%-101.2%。

          
        洪旭|段夢霞|吳世佳|段諾
        江南大學食品科學與資源國家重點實驗室,中國無錫214122

        摘要

        單核細胞增生李斯特菌作為一種典型的食源性病原體,容易污染多種食品,對食品安全和全球公共衛生構成嚴重威脅。因此,開發靈敏且精確的單核細胞增生李斯特菌檢測方法至關重要。在本研究中,建立了一種基于G-四鏈結構的無標記比色和熒光適配體傳感器,用于準確檢測單核細胞增生李斯特菌。多孔ZIF-90材料被用作載體,用于封裝血紅素和硫黃素T(ThT)信號分子,并涂覆銻(Sb)納米顆粒(Sb@ZIF-90@hemin@ThT)。隨后,通過靜電相互作用將特異性針對單核細胞增生李斯特菌的適配體加載到復合材料中,以進一步密封信號分子。當適配體與單核細胞增生李斯特菌結合時,G-四鏈適配體從復合材料表面分離,釋放出血紅素和ThT,這些分子進一步插入四鏈結構中。生成的G-四鏈/血紅素將TMB催化為藍色氧化TMB,而G-四鏈/ThT則增強了熒光強度。優化后的系統顯示出從10到106 CFU/mL的寬線性檢測范圍,檢測限(LOD)為10 CFU/mL。該平臺成功應用于牛奶和生菜樣本,回收率在94.4%到101.2%之間,顯示出在食品和環境樣本中準確檢測單核細胞增生李斯特菌的強大潛力。

        引言

        單核細胞增生李斯特菌是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌,具有顯著的適應性,能夠在各種惡劣環境中生存,包括低溫、高氯化鈉濃度和低pH值(Da Silva & De Martinis, 2013)。這種病原體的污染范圍廣泛,涉及多種食品基質,如乳制品(例如酸奶、奶酪)、畜禽肉類(例如新鮮肉、火腿、熏肉、禽類產品)、水產品(海鮮)和蔬菜。人類攝入含有單核細胞增生李斯特菌的食品可能導致李斯特菌病,常見臨床癥狀包括肌肉疼痛、發熱、惡心、嘔吐和腹瀉(Eallonardo & Freitag, 2023)。在嚴重情況下,病情可能發展為侵襲性感染,如敗血癥和腦膜炎。受感染的孕婦還可能經歷早產、死產或流產,對公共衛生構成重大威脅(Duan et al., 2018; Chen et al., 2024)。
        目前,單核細胞增生李斯特菌的檢測方法包括平板菌落計數、分子生物學檢測和免疫測定方法。雖然傳統的平板計數方法準確性高,但其漫長的檢測周期(通常超過7天)和繁瑣的操作程序使其不適合快速檢測需求(Jadhav et al., 2018; Vidovic et al., 2024)。分子生物學方法,如聚合酶鏈反應、定量聚合酶鏈反應、環介導等溫擴增和基于核酸序列的擴增,可以顯著縮短單核細胞增生李斯特菌的檢測時間。然而,這些方法依賴于專用儀器、訓練有素的操作人員以及嚴格的樣品預處理,限制了其在現場快速檢測中的應用(Law et al., 2015)。免疫測定方法靈敏且高效,但對抗體制備有嚴格要求,并且容易受到其他雜菌的干擾(Osek et al., 2022)。
        基于適配體的生物傳感器,即適配體傳感器,因其高特異性、強穩定性和易于合成以及低免疫原性而受到廣泛關注(Guo et al., 2021)。它已廣泛應用于食品安全檢測、臨床診斷和環境監測等領域(Sun et al., 2025)。Du等人(2024)開發了一種基于適配體特異性捕獲和金納米顆粒催化活性的比色傳感器,用于檢測牛奶中的單核細胞增生李斯特菌。然而,這種依賴于單一信號輸出的傳感方法在面對復雜基質干擾時容易產生非特異性響應,從而影響檢測結果的準確性。近年來,隨著多功能納米材料的進步,適配體傳感器的檢測信號輸出已從單信號模式升級為多信號模式(Zhao et al., 2023)。例如,Yang等人(2025)構建了一種電化學發光/熒光雙模式適配體傳感器,用于檢測大腸桿菌 O157:H7。改良后的適配體通過Ag-S鍵共價固定在HOF-101@AgNPs復合材料表面,形成標記的雙信號傳感探針。這種復合材料可以通過π→π*電子躍遷產生熒光信號,并與TPrA發生氧化還原反應,產生電化學發光信號,從而實現雙信號的協同輸出。基于此構建的適配體傳感器不僅具有寬線性范圍和低檢測限(LOD),還具有出色的選擇性、重復性和穩定性,為食品安全檢測提供了一種非常有前景的技術方法(Fu et al., 2025)。
        盡管具有多信號交叉驗證和強抗干擾能力等優點,基于多功能材料的雙模式傳感檢測方法仍受到復雜材料制備過程和高成本的限制。此外,適配體需要經過修飾和標記,這不僅增加了實驗操作的復雜性,還可能由于空間位阻效應影響適配體與目標之間的結合活性(Zou et al., 2025)。無標記傳感技術避免了繁瑣的標記程序,降低了實驗成本,并最大程度地保留了生物分子的天然生物活性(Wang et al., 2025)。在無標記傳感系統中,檢測信號通常由適配體的構象變化觸發,尤其是G-四鏈(G4)結構。這種構象可以通過信號分子轉化為可量化的物理或化學信號,從而實現目標的定量檢測。例如,Chen等人(2025)開發了一種基于血紅素/G-四鏈DNA酶的比色傳感器,該酶表現出類似過氧化物酶的活性,能催化TMB生成比色信號。Li等人(2024)報道了一種無標記熒光適配體,其中硫黃素T(ThT)插入G4結構以產生增強的熒光信號。
        由于游離的血紅素和ThT容易受到環境因素的影響,從而影響檢測的準確性和穩定性。近年來,金屬有機框架(MOF)材料因其可調孔徑、大比表面積和高穩定性等優勢而在檢測和分析領域受到廣泛關注(Fatah & Omer, 2025)。其中,ZIF-90作為沸石咪唑框架(ZIFs)材料的典型代表,是一種由鋅離子和2-甲基咪唑配體通過配位鍵組裝而成的三維多孔材料(Wang et al., 2024)。由于其豐富的孔結構和大的比表面積,它已成為封裝客體分子的優秀納米載體(Wang et al., 2022; Zheng et al., 2025)。例如,Zhang等人(2025)利用ZIF-90的多孔結構和自組裝特性制備了hemin@ZIF-90納米酶,并將其整合到生物傳感平臺中,用于高靈敏度檢測鼠傷寒沙門氏菌。ZIF-90表現出高效的裝載能力、結構穩定性,并能為血紅素提供穩定的微環境,從而保護其免受外部因素對其催化活性的影響。
        然而,同時將血紅素和ThT與G-四鏈結合以制備無標記雙模式檢測食源性病原體的方法鮮有報道。本文構建了一種基于ZIF-90作為載體的比色/熒光雙模式檢測平臺,用于檢測單核細胞增生李斯特菌,通過ZIF-90封裝血紅素和ThT信號分子,并結合具有G4結構的適配體來產生信號變化。該方法不僅保留了適配體識別的高特異性和無標記操作的便利性,還實現了雙信號的相互驗證,有望為食品樣本中單核細胞增生李斯特菌的快速、準確和現場檢測提供一種新方法。

        材料與儀器

        醋酸鋅二水合物(Zn(CH3COO)2·2H2O,≥ 99.0%,AR)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF,≥ 99.5%,AR)、2-甲酰基咪唑(2-IFA,≥ 97.0%,AR)、N-甲基吡咯烷酮(NMP,≥ 99.5%,AR)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB,≥ 99.0%,AR)、二甲基亞砜(DMSO,≥ 99.7%,AR)、銻粉、血紅素(≥ 98.0%,AR)和ThT(≥ 95.0%,AR)均購自上;ぴ噭┯邢薰。適配體(5’-ATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGGGGGGGGTACCCGGTTGAT-3’)對

        基于G-四鏈結構的無標記比色和熒光適配體傳感器原理

        基于G-四鏈結構的無標記比色和熒光適配體傳感器原理如圖1所示。首先制備多孔ZIF-90材料,然后封裝血紅素和ThT信號分子。隨后,通過范德華力、靜電吸引和配位效應等多種界面相互作用,在ZIF-90@hemin@ThT表面涂覆Sb納米顆粒

        結論

        本研究建立了一種基于G-四鏈結構的無標記適配體傳感器,用于準確檢測單核細胞增生李斯特菌,使用多孔ZIF-90材料作為載體封裝血紅素和ThT信號分子,并涂覆Sb納米顆粒。得益于G-四鏈/血紅素復合物的優異催化活性以及G-四鏈/ThT復合物的增強熒光信號,實現了比色和熒光的雙模式檢測平臺。

        CRediT作者貢獻聲明

        洪旭:撰寫——原始草稿、軟件開發、方法論設計、實驗研究、數據分析、概念構建。段諾:撰寫——審稿與編輯、項目監督、資源協調、資金獲取、概念構思。段夢霞:數據可視化、軟件應用、方法論設計。吳世佳:實驗驗證

        未引用參考文獻

        Ma et al., 2022.

        利益沖突聲明

        作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。

        致謝

        本研究部分得到了國家重點研發計劃(2025YFD2100500)、國家自然科學基金(32272449)、江蘇省基礎研究計劃(BK20240100)以及江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心的支持。
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