小麥是全球主要的糧食作物，但也是導致食物相關疾病（包括小麥過敏和乳糜瀉）的主要原因，影響了全球約2.9%的人口（FAO, 2024; Martre et al., 2024）。對于這些患者來說，嚴格遵循無麩質飲食（GFD）是唯一有效的治療方法。國際標準要求無麩質食品中的麩質含量必須低于20 mg/kg（Iglesia, Kwan, Virkud, & Iweala, 2024）。然而，尤其是對于加工食品，可靠的合規性監測仍然是一個重大挑戰。
這一挑戰因現代食品制造中廣泛使用熱處理方法（如烘焙、油炸和煮沸）而加劇（Khashaba et al., 2025; Luparelli et al., 2025; Rodríguez, Bongianino, León, & Bustos, 2025; Zhang, Li, Nie, Yang, & Zhu, 2025）。這些過程會導致蛋白質變性、聚集和斷裂，從而破壞ELISA抗體識別的表位，并降解傳統用于液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）方法的肽靶標（Cabanillas, 2019; De Graaf et al., 2024）。因此，基于傳統質譜的方法可能會低估麩質含量，對易感個體構成嚴重的健康風險（Millet et al., 2021; Schuster, Huen, Weiss, & Scherf, 2024）。盡管LC-MS/MS因其特異性和能夠監測多個靶標而成為一種優越的技術，但其準確性在加工食品中的應用嚴重依賴于所選標志肽的穩定性（Rasheed et al., 2025）。例如，Li等人使用16種商業食品篩選肽來檢測芝麻過敏原，并最終選擇了9種最佳肽作為商業食品中過敏原檢測的生物標志物（Li et al., 2025）。Henrottin等人在研究巧克力過敏原時也表明，特征肽的熱穩定性是LC-MS/MS準確定量的前提條件（Henrottin et al., 2023）。因此，過敏原檢測的關鍵挑戰已從儀器靈敏度轉移到用于定量的分子標志物的熱穩定性上。
目前的方法通常依賴于從未加工（天然）蛋白質中鑒定出的標志肽或僅通過計算機模擬標準選出的肽，但這些肽可能無法在工業加工過程中存活（Van Gils & Simrén, 2025; Xu et al., 2025）。例如，Henrottin等人在使用LVVDQQLAGR（HMW-G）、VFLQQCSPVAMPQSLAR（LMW-G）和NYLLQQCNPVSLVSSLVSMILPR（Gamma-Gliadin）等肽檢測加工食品中的麩質過敏原時出現了假陰性結果。這表明，如果不對這些肽的熱穩定性進行預先評估，可能會導致定量誤差，從而削弱熱處理產品的無麩質聲明（Henrottin et al., 2019）。為了解決這個問題，我們假設系統地選擇具有內在耐熱性的標志肽將為建立一種能夠準確測量加工食品中過敏原的可靠定量方法奠定基礎。在這里，我們描述了一種靶向蛋白質組學策略，旨在系統地識別和驗證兩種主要小麥過敏原的耐熱標志肽。該方法包括四個關鍵階段：首先，通過模擬工業加工條件的熱處理對小麥面團進行熱處理實驗；接著，使用數據獨立獲取（DIA）質譜技術定量分析小麥蛋白質組，并識別在熱處理后穩定性增強或消化性提高的蛋白質；然后利用計算機模擬消化工具合理選擇這些耐熱蛋白質的候選肽，并通過嚴格的生物信息學評估（通過BLAST）確保其特異性，避免易降解或修飾的基序；最后，通過靶向超高效液相色譜-串聯質譜（UHPLC-MS/MS）實證驗證這些肽的穩定性、可檢測性和適用性。
利用這種綜合方法，我們成功鑒定了HMW-G的QYEQQPVVPSK和LEGSDALSTR以及LMW-G的VNVPLYR作為新的耐熱標志肽。基于這些可靠的生物標志物，我們開發并驗證了一種高靈敏度和準確的穩定同位素稀釋UHPLC-MS/MS方法。該方法被嚴格應用于薯片和魚糜等復雜商業基質中隱藏過敏原的定量，證明了其在確保食品安全和保護消費者健康方面的實際效用。
