《npj Biosensing》：Plasmon-enhanced bioassay for amplification-free detection and quantification of SARS-CoV-2 RNA
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為了滿足對兼具低成本、操作簡便、高靈敏度、準確定量和嚴格可靠性等特征的新一代診斷技術的迫切需求，研究人員開展了一項關于等離激元增強熒光免疫分析（p-FLISA）的研究。該研究利用S9.6單克隆抗體特異性識別DNA-RNA異源雙鏈的原理，實現了對COVID-19患者樣本中SARS-CoV-2 RNA的靈敏、準確定量和無擴增檢測。與ELISA金標準相比，其檢測限（LOD）和定量下限（LLOQ）分別降低了超過200倍和70倍，數字格式的分析更展現出近2300倍的LOD改進。該方法無需核酸擴增步驟，其臨床敏感性和特異性與RT-PCR相當，但可提供病毒RNA的絕對定量，有望用于判斷疾病階段和患者傳染性，為傳染病的現場即時定量診斷提供了新策略。
一場席卷全球的疫情，讓“核酸檢測”成為了公眾熟知的詞匯。作為RNA病毒感染診斷的“金標準”，逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術雖然高度靈敏和特異，但其漫長的擴增過程、對昂貴笨重設備的需求，使其主要局限在中心實驗室，難以滿足在人群篩查、現場即時等廣泛場景下的應用需求。更重要的是，RT-PCR在缺乏適當參照樣本的情況下，通常只能給出定性結果（陽性/陰性），難以準確定量病毒RNA的濃度。雖然CRISPR、等溫擴增、側向流免疫層析等方法在成本和便捷性上有所提升，但在檢測靈敏度、特異性，特別是對病毒載量的準確定量能力上，仍難以與RT-PCR匹敵。能否開發一種兼具RT-PCR的精準、又無需復雜擴增步驟的快速、簡易、超靈敏檢測平臺，成為生物傳感領域一個亟待解決的挑戰。
近期發表在《npj Biosensing》上的一項研究，為這一難題帶來了創新性的解決方案。研究者們巧妙地利用了一種能特異性識別DNA-RNA異源雙鏈結構的單克隆抗體S9.6，結合一種名為“等離激元熒光體”（plasmonic-fluor）的超亮熒光納米標記物，開發出一種新型的等離激元增強熒光免疫吸附分析（Plasmon-Enhanced FluoroLinked Immunosorbent Assay, p-FLISA），實現了對SARS-CoV-2 RNA的無擴增、超靈敏和絕對定量檢測。
為開展這項研究，研究者們主要運用了以下幾項關鍵技術方法：1. 利用S9.6抗體構建了針對DNA-RNA異源雙鏈的夾心免疫分析平臺；2. 合成并使用了亮度比傳統熒光染料高三個數量級的等離激元熒光納米標簽（plasmonic-fluor）作為信號報告分子；3. 開發了數字p-FLISA技術，通過顯微鏡成像和圖像處理算法對單個納米標簽進行計數，實現了從“模擬”到“數字”的檢測方式轉變；4. 對來自COVID-19患者（包括不同變異株感染者）的鼻咽拭子和唾液樣本進行了檢測，并與RT-PCR結果進行比對驗證，樣本來自華盛頓大學醫學院的臨床樣本庫。
研究結果
等離激元增強的DNA-RNA異源雙鏈分析：研究設計了三種檢測方法（Method I, II, III），核心都是利用S9.6抗體捕獲靶標RNA與互補DNA探針雜交形成的異源雙鏈，再通過生物素-鏈霉親和素系統引入等離激元熒光體進行信號放大。實驗證明，與傳統的鏈霉親和素-Cy5熒光染料相比，等離激元熒光體-650（PF650）的熒光信號強度高出近1100倍，為超高靈敏度檢測奠定了物理基礎。特異性驗證實驗表明，該方法能有效區分目標RNA-DNA異源雙鏈與單鏈RNA、單鏈DNA及其他非特異性RNA，背景信號與空白對照無顯著差異。
檢測限與定量下限的顯著提升：研究者通過繪制劑量-反應標準曲線，系統評估了p-FLISA的分析性能。以SARS-CoV-2的N基因為例，傳統ELISA的檢測限（LOD）和定量下限（LLOQ）分別為1.73 fM和10.8 fM。而三種p-FLISA方法（Method I, II, III）的平均LOD達到了aM（10-18M）級別，LLOQ也降低至數十aM。與ELISA相比，模擬p-FLISA的LOD和LLOQ分別實現了超過230倍和77倍的改善。其中，Method II（使用生物素化DNA探針直接檢測）的檢測時間最短，被選用于后續臨床樣本分析。
數字p-FLISA的極限靈敏度：為進一步突破靈敏度極限，研究引入了數字免疫分析策略。不同于測量微孔板平均熒光強度的“模擬”模式，數字p-FLISA通過顯微鏡對結合在板底的單個等離激元熒光體進行計數。結果顯示，對于SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因，數字p-FLISA的LOD分別低至1.2 aM和0.8 aM，比模擬p-FLISA進一步提高了10-30倍，比傳統ELISA實現了驚人的近2300倍的LOD改善和460倍的LLOQ改善。
臨床樣本驗證與性能評估：該方法在真實臨床樣本中展現了卓越的性能。研究檢測了來自Delta和Alpha/Beta變異株感染者的鼻咽拭子及唾液樣本，結果顯示p-FLISA測定的病毒RNA濃度與RT-PCR的循環閾值（Ct值）呈現良好的負相關（Pearson's r2=0.37），并能區分出Delta變異株患者更高的病毒載量。對于SARS-CoV-2陰性樣本以及其他呼吸道病毒（如HCoV-NL63、鼻病毒、腺病毒）感染者的樣本，p-FLISA均未檢出，顯示了100%的臨床敏感性和優秀的特異性。相比之下，在同樣的20份臨床樣本子集中，p-FLISA全部檢出，而ELISA僅檢出6份，凸顯了新方法的顯著優勢。
研究結論與意義
綜上所述，這項研究成功開發并驗證了一種基于等離激元增強和S9.6抗體的超靈敏、定量、無擴增RNA檢測平臺。其核心結論在于：1. 模擬p-FLISA相比金標準ELISA，實現了超過200倍的LOD降低和70倍的LLOQ降低；2. 數字p-FLISA進一步將這一優勢擴大到約2300倍（LOD）和460倍（LLOQ）；3. 該方法的臨床敏感性和特異性與RT-PCR相當，但無需復雜的核酸擴增步驟；4. 最關鍵的是，它能夠提供病毒RNA的絕對濃度定量，而不僅僅是RT-PCR的定性或半定量Ct值，這為評估患者的疾病階段、病毒載量變化和潛在的傳染性風險提供了更直接、更具臨床意義的數據。
這項工作的意義遠超對SARS-CoV-2的單一樣本檢測。其方法學具有普適性：通過設計針對不同靶標RNA的互補DNA探針，該技術可輕松適配用于其他傳染病病原體RNA、microRNA等各類RNA目標的檢測。此外，該平臺為開發下一代即時檢驗（Point-of-Care, POC）設備奠定了堅實基礎，例如可將其轉化為基于等離激元增強的側向流免疫層析試紙條，實現現場、快速、超靈敏的定量診斷。因此，這項研究不僅為應對COVID-19乃至未來新發傳染病的診斷挑戰提供了一項強有力的工具，也推動了超靈敏生物傳感和定量免疫分析技術本身的發展。
