人參皂苷化合物K抑制了GGGCC重復序列的凝膠化，并調(diào)節(jié)了其與富含精氨酸的多肽在C9orf72相關肌萎縮側索硬化癥（ALS）中的共聚集現(xiàn)象
《International Journal of Biological Macromolecules》：Ginsenoside compound K inhibited the gelation of GGGGCC repeats and regulated
co-aggregation with arginine-rich poly-dipeptides in C9orf72-related ALS
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人參皂苷K通過抑制G-四聯(lián)體RNA凝膠化及與多肽共聚集，減少C9orf72相關ALS/FTD的毒性RNA焦點形成，為神經(jīng)退行性疾病治療提供新策略。
李友端|劉書杰|曹玲玲|朱明|林雙|王新欣|邱志東|滕葉
長春中醫(yī)藥大學藥學院，中國長春市博碩路1035號，郵編1301171
摘要
C9orf72基因中的GGGGCC重復序列擴展是導致肌萎縮側索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）最常見的遺傳原因。這種擴展會產(chǎn)生有毒的RNA重復序列和多肽，從而導致神經(jīng)細胞中的異常相分離和沉積。特別是，這些重復RNA會形成凝膠，引發(fā)細胞毒性。因此，它們成為潛在的治療靶點。人參皂苷K（CK）是人參的主要代謝產(chǎn)物，人參是一種常用于治療神經(jīng)退行性疾病的傳統(tǒng)中藥。在本研究中，CK在體外和體內(nèi)均顯著抑制了GGGGCC重復序列的凝膠化過程。此外，它還通過靜電相互作用減少了RNA和富含精氨酸的多肽的聚集。進一步的研究表明，CK優(yōu)先與GGGGCC重復序列形成的G四鏈體單體相互作用，從而抑制了有毒RNA焦點的形成。這些結果闡明了CK在C9orf72相關ALS/FTD中的作用機制。因此，本研究為人參皂苷在神經(jīng)退行性疾病治療中的應用提供了新的途徑。
引言
C9orf72基因中的GGGGCC重復序列擴展是導致肌萎縮側索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）最常見的遺傳原因[1] [2]。其主要機制包括C9orf72功能的喪失、有毒RNA重復序列的產(chǎn)生以及有毒RNA和多肽的積累[3]。這些重復序列會形成各種二級結構，如發(fā)夾結構、G四鏈體、i基序和R環(huán)[4] [5] [6]，這會導致DNA在復制和轉錄過程中的損傷增加和基因組不穩(wěn)定[7]。轉錄后的RNA重復序列會與RNA結合蛋白形成有毒RNA焦點，導致蛋白質(zhì)的隔離[3]。此外，這些轉錄后的重復RNA可以通過非ATG翻譯（RAN翻譯）產(chǎn)生多肽，包括聚甘氨酸-丙氨酸（poly-GA）、聚甘氨酸-脯氨酸（poly-GP）、聚甘氨酸-精氨酸（poly-GR）、聚脯氨酸-丙氨酸（poly-PA）和聚脯氨酸-精氨酸（poly-PR）[8]。這些多肽會損害神經(jīng)系統(tǒng)[9]。例如，poly-GR和poly-PR會與mRNA形成不溶性復合物，阻斷其翻譯[10]；poly-PR會結合到核孔上，阻斷核質(zhì)運輸[11]；同樣，Poly-GA會形成有毒的淀粉樣蛋白，影響核質(zhì)運輸和細胞間信號傳遞[12]。
由重復RNA形成的RNA焦點在神經(jīng)元中頻繁出現(xiàn)，并與病理疾病特征相關。因此，它們引起了廣泛的研究興趣。像CAG和GGGGCC這樣的重復序列通過多價堿基配對形成凝膠，這有助于神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病[13]。特別是，由于其高GC含量，GGGGCC重復序列會形成多種二級結構，包括分子內(nèi)和分子間的G四鏈體及發(fā)夾結構，這些結構與RNA焦點的形成有關。因此，近年來針對GGGGCC重復序列的研究成為C9orf72相關ALS研究的重要課題。多種蛋白質(zhì)可以與GGGGCC重復序列結合，調(diào)節(jié)RNA焦點的表達和形成。例如，異質(zhì)核核糖核蛋白A3和鋅指蛋白106可以與GGGGCC重復序列結合，減少RNA焦點并抑制多肽的積累[14] [15]。另外，改變GGGGCC重復序列的結構可能是一種有前景的治療方法。Miyoshi等人[16]發(fā)現(xiàn)，胞嘧啶甲基化可以通過調(diào)節(jié)G四鏈體的拓撲結構（從平行結構變?yōu)榉雌叫薪Y構）來抑制其相分離。此外，小分子配體ANP77可以與反義GGCCCC重復序列中的胞嘧啶形成偽規(guī)范堿基對，顯示出其在針對RNA驅(qū)動性疾病中的非規(guī)范核酸結構方面的潛力[17]。
人參是一種常用于治療神經(jīng)退行性疾病的傳統(tǒng)草藥[18] [19]。現(xiàn)代藥理學研究證實，人參對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)具有顯著作用[20] [21]，但其藥理作用機制尚不清楚。人參皂苷是人參中的主要活性成分，目前已鑒定出200多種不同類型的人參皂苷[22]。人參皂苷K（CK）是原人參二醇皂苷的主要代謝產(chǎn)物，具有抗炎、抗癌、抗衰老和神經(jīng)保護等多種生物活性[23] [24] [25]。在之前的研究中，CK通過促進G四鏈體的折疊和調(diào)節(jié)含有G四鏈體的癌基因的表達，影響了雙鏈體和G四鏈體的平衡[26]。其在調(diào)節(jié)核酸結構方面的潛力表明，它在延緩神經(jīng)退行性病變發(fā)展中起著重要作用。本研究在體外和體內(nèi)探討了CK對GGGGCC重復序列凝膠化的影響。在CK的作用下，有毒RNA焦點的形成被抑制，同時RNA重復序列和富含精氨酸的多肽（如poly-GR和poly-PR）的聚集也被減少。因此，CK的治療效果為藥物開發(fā)提供了新的途徑，并突顯了其在神經(jīng)退行性疾病治療中的潛在應用。
試劑和材料
DNA序列購自上海 Sangon生物技術有限公司（中國上海），無需進一步純化即可使用。序列信息列于表S1中。T7 RNA聚合酶、DNase I、重組RNase抑制劑和rNTPs購自Takara生物醫(yī)學技術有限公司（中國北京）。所有其他試劑均來自上海源葉生物技術有限公司（中國上海）。溶液均使用Barnstead Smart2Pure純化的蒸餾水配制。
CK抑制了GGGGCC重復序列的凝膠化
在體外轉錄后觀察到了GGGGCC重復序列的凝膠化現(xiàn)象。設計了一個包含八個GGGGCC重復序列和T7啟動子區(qū)域的模板（圖1A）。轉錄2小時后，通過變性凝膠電泳對轉錄產(chǎn)物進行了分析。如圖S1所示，在有無CK的情況下，轉錄產(chǎn)物的數(shù)量沒有顯著差異。這表明CK對GGGGCC重復序列的表達水平影響很小。
討論
RNA和蛋白質(zhì)的相分離是無膜細胞器形成和調(diào)控的關鍵因素，因此在與年齡相關的疾病研究中受到了關注。RNA的相分離受到RNA結構的嚴格控制。特別是在重復序列擴展相關疾病中，擴展的RNA重復序列會形成多種分子間結構，如發(fā)夾結構、G四鏈體和i基序，從而導致有毒RNA凝膠的形成。
結論
CK抑制了GGGGCC重復序列的凝膠化，并影響了RNA重復序列和富含精氨酸的多肽的聚集。本研究提供了基于證據(jù)的機制，說明CK在分子水平上如何延緩神經(jīng)退行性病變的發(fā)展。人參皂苷及其類似化合物可能是開發(fā)治療以異常蛋白質(zhì)和RNA聚集為特征的神經(jīng)退行性疾病的新方法的寶貴資源。
作者貢獻聲明
李友端：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、驗證、方法學設計、實驗設計、概念構思。
劉書杰：驗證、方法學設計、實驗設計。
曹玲玲：資源提供。
朱明：驗證。
林雙：數(shù)據(jù)可視化。
王新欣：數(shù)據(jù)可視化。
邱志東：撰寫 – 審稿與編輯、實驗監(jiān)督、資源提供。
滕葉：概念構思、資源提供、實驗監(jiān)督、初稿撰寫、審稿與編輯。
資助
本研究得到了國家自然科學基金 [項目編號：82204650]和吉林省自然科學基金 [項目編號：YDZJ202501ZYTS223]的支持。
利益沖突聲明
作者聲明沒有利益沖突。
