《Analyst》：Continuous monitoring of glutamate using electroactive templated polymers as synthetic molecular receptors
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本文介紹了一種創新的、非酶依賴性谷氨酸（Glu）電化學傳感器。該傳感器利用谷氨酸分子模板化的刺激響應聚合物（poly (NIPAM-VP-MAA)-g-Os(bpy)2Cl）作為合成受體，通過靶標結合誘導的聚合物構象變化（折疊/展開）產生可逆的電化學信號（SWV）。該傳感器在人工腦脊液（ACSF）和小鼠血清中實現了高選擇性、約1分鐘時間分辨率的谷氨酸實時監測，為研究神經精神疾病中的谷氨酸能信號傳導提供了極具潛力的新工具。
谷氨酸（Glu）是中樞神經系統中最重要的興奮性神經遞質，廣泛參與學習、記憶、長時程增強和突觸可塑性等關鍵腦功能。越來越多的證據表明，谷氨酸能信號傳導功能障礙與多種神經和精神疾病的病理生理過程密切相關，包括癲癇、阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥，甚至藥物成癮和癌癥進展。因此，在腦組織中實現對谷氨酸的準確、可靠、高時空分辨率的監測，對于深入理解其在細胞水平的傳輸機制、功能以及對精神健康狀況的影響至關重要。然而，實現這一目標面臨諸多挑戰，主要原因是缺乏能夠同時提供高靶標選擇性和連續測量能力的谷氨酸結合受體。現有技術如全細胞膜片鉗、微透析、酶促生物傳感器和基因編碼光學傳感器（如iGluSnFR）等，各自在化學選擇性、時空分辨率、長期穩定性或檢測范圍方面存在局限。
為應對這些挑戰，本研究開發了一種基于聚合物的新型電化學生物傳感器，旨在顯著提升對谷氨酸的選擇性檢測能力。該傳感器的核心創新在于采用了一種模板化聚合物（poly (NIPAM-VP-MAA)-g-Os(bpy)2Cl）作為合成分子受體。該聚合物在合成過程中以N-甲基-L-谷氨酸（N-mGlu，因其在溶劑中溶解性優于L-Glu而被用作模板）為模板，從而在聚合物鏈上形成了對谷氨酸分子具有高親和力的特異性結合位點。聚合物鏈上接枝的鋨（Os）絡合物作為氧化還原標簽。其檢測機制依賴于靶標（谷氨酸）結合誘導的聚合物構象變化：在特定緩沖環境（如人工腦脊液ACSF）中，無靶標時聚合物保持折疊構象，使氧化還原標簽靠近電極表面，從而產生較強的方波伏安法（SWV）峰電流（信號開啟狀態）；而當谷氨酸與聚合物結合時，會觸發聚合物從折疊態向展開態的轉變，導致氧化還原標簽遠離電極表面，SWV峰電流隨之降低（信號關閉狀態）。這種可逆的結合動力學使得傳感器能夠實現谷氨酸的連續檢測，時間分辨率可達約1分鐘，在ACSF中的檢測限低至88.5 nM。
聚合物表征與結合親和力驗證
通過核磁共振（NMR）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和凝膠滲透色譜（GPC）等手段確認了聚合物的成功合成及其分子特性。表面等離子體共振（SPR）分析進一步定量評估了聚合物對模板分子N-mGlu的結合親和力。結果表明，模板化聚合物對N-mGlu的解離常數（KD）為0.95 μM，顯著優于非模板化聚合物的5.85 μM，有力證明了分子模板化過程有效增強了聚合物對靶標（及其結構類似物）的特異性識別能力。
在ACSF和小鼠血清中的電化學檢測性能
在生理相關緩沖液ACSF中，該傳感器對谷氨酸表現出濃度依賴性的“信號關閉”響應，檢測線性范圍在10 nM至500 nM之間。重要的是，傳感器在面對其他可能干擾的神經化學物質，如γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸和天冬氨酸時，展現出了對谷氨酸的高選擇性，盡管對GABA存在一定程度的交叉反應，這可能源于二者分子結構的相似性。為了驗證傳感器在真實生物樣本中的實用性，研究進一步在小鼠血清中進行了測試。結果同樣觀察到了濃度依賴性的信號響應，且SWV曲線在血清中比在ACSF中更為穩定，這歸因于血清具有更優異的pH緩沖能力。這些結果共同證明了該傳感器平臺在復雜生理環境中檢測谷氨酸的可行性。
信號機制的頻率與離子依賴性
研究還深入探討了傳感器信號機制的復雜性。首先，信號響應模式（“信號開啟”或“關閉”）不僅受靶標結合影響，還與測量所用SWV的頻率密切相關。實驗發現，在低頻率（1-5 Hz）下，傳感器對谷氨酸的響應表現為“信號開啟”，而在高頻率（10-100 Hz）下則轉變為“信號關閉”。本研究選擇5 Hz作為測量頻率，以兼顧較快的采樣時間和足夠的靈敏度。其次，緩沖液中陰離子的類型（霍夫邁斯特效應）對聚合物初始構象有決定性作用。在離液序列較高的高氯酸鹽（ClO4-）緩沖液中，聚合物初始呈展開態，靶標結合導致其折疊，產生“信號開啟”響應；而在ACSF這種含有較多易水化離子（促水結構離子）的緩沖液中，聚合物初始為折疊態，靶標結合使其展開，從而產生“信號關閉”響應。這表明傳感器的檢測機制高度依賴于其工作環境的化學組成。
谷氨酸的連續實時監測
為評估傳感器在動態環境中的性能，研究進行了連續實時監測實驗。通過順序滴加不同濃度（0, 1, 20, 100, 200, 500 nM, 1 μM）的谷氨酸ACSF溶液，并連續記錄SWV峰電流，傳感器成功追蹤了谷氨酸濃度的階躍變化。盡管在濃度變化后達到穩定響應需要約1分鐘的時間（可能源于聚合物形態調整或電極表面聚合物鏈間的相互作用），但這初步證明了其用于實時監測的潛力。在連續測量模式下，傳感器對甘氨酸和天冬氨酸的響應可忽略不計，對GABA雖有輕微響應，但幅度遠低于相同濃度的谷氨酸，再次印證了其良好的選擇性。
結論與展望
本研究成功開發了一種基于刺激響應性模板聚合物的非酶促谷氨酸電化學生物傳感器。該傳感器利用靶標結合誘導的聚合物構象變化產生電化學信號，在生理相關環境（ACSF和小鼠血清）中實現了對谷氨酸的高選擇性、可逆和接近實時的檢測。雖然目前其時空分辨率相較于膜片鉗、iGluSnFR等成熟技術尚有差距，但該平臺因其簡單的設計和架構，通過進一步的器件微型化、聚合物表面覆蓋度精確控制以及結合先進的機器學習算法進行信號處理，具有顯著提升性能的潛力。這項工作為在生理模型中直接、持續監測谷氨酸濃度動態變化提供了一種有前景的新工具，未來可進一步發展為植入式線型探針，用于腦切片或活體組織的神經化學原位分析，為神經科學研究和神經精神疾病的機理探索與診療監測開辟新途徑。
