《Insect Science》：Characterization of the dynamic microbiome evolution across thrips species
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本文通過整合宏基因組學(xué)與培養(yǎng)組學(xué)方法，首次系統(tǒng)解析了薊馬物種間微生物組的動態(tài)進化格局。研究發(fā)現(xiàn)，薊馬微生物組由胞內(nèi)共生體（如Wolbachia、Spiroplasma）和胞外類群（如Pantoea、Serratia）共同主導(dǎo)，呈現(xiàn)出頻繁的菌株獲得與丟失，且物種間微生物共享度極低，形成了高度宿主特異性的細(xì)菌群落。研究開發(fā)了短讀長與長讀長（Nanopore）測序結(jié)合的雙重驗證框架，成功重建了高質(zhì)量的宏基因組組裝基因組（MAGs），并從宿主腸道中分離、測序了Pantoea dispersa和Serratia marcescens兩種優(yōu)勢共生菌的完整基因組。泛基因組分析揭示了它們具有小而保守的核心基因集和龐大的附屬基因組，其中包含可能與宿主適應(yīng)相關(guān)的功能基因（如水解酶、神經(jīng)毒性N-乙酰轉(zhuǎn)移酶）。該研究為深入理解薊馬微生物組的進化動力學(xué)及其在宿主適應(yīng)中的作用提供了關(guān)鍵基因組資源與標(biāo)準(zhǔn)化分析流程。
薊馬微生物組的組成與多樣性
本研究旨在揭示薊馬（Thysanoptera）微生物組的組成與進化動態(tài)。通過對包括豆花薊馬（Megalurothrips usitatus）云南種群在內(nèi)的13個樣本（涵蓋11個物種）進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建了薊馬宿主的系統(tǒng)發(fā)育樹，其分化時間可追溯至約1.97億年前。研究發(fā)現(xiàn)，薊馬微生物組主要由胞內(nèi)共生菌（如Wolbachia和Spiroplasma）和胞外細(xì)菌（如Pantoea、Serratia和Acinetobacter）組成，具體組成具有顯著的物種特異性。利用Kraken2、SingleM和基于長讀長（PacBio HiFi/CLR, Nanopore）的宏基因組組裝三種方法進行表征，結(jié)果相互驗證，揭示了微生物組組成的復(fù)雜性。例如，Kraken2在所有樣本中均檢測到高豐度的Streptomyces，但SingleM和長讀長組裝均未檢出，后續(xù)PCR驗證也呈陰性，表明Kraken2可能存在誤分類。主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，微生物群落結(jié)構(gòu)相似性與宿主系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不完全一致，例如，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的Dendrothrips minowai和Stenchaetothrips biformis卻擁有相似的微生物組。
微生物豐度、菌株共存與宿主特異性
通過長讀長數(shù)據(jù)組裝獲得高質(zhì)量的宏基因組組裝基因組（MAGs），并計算了細(xì)菌在宿主內(nèi)的豐度（Titer）。胞內(nèi)共生菌Wolbachia和Spiroplasma顯示出最高的相對豐度，例如在Odontothrips loti中Wolbachia的豐度達2.59倍。值得注意的是，Wolbachia和Spiroplasma似乎不共生于同一宿主。胞外細(xì)菌Pantoea和Serratia的豐度較低，但分布廣泛。研究在物種和菌株水平上發(fā)現(xiàn)了精細(xì)的微生物多樣性。例如，Pantoea dispersa特異性地存在于三個M. usitatus種群和O. loti中，而Pantoea ananatis則棲息于D. minowai、S. biformis和Thrips tabaci中。更為復(fù)雜的是，在T. tabaci體內(nèi)，同時檢測到Serratia rubidaea、Serratia rhizosphaerae以及兩個不同的Serratia marcescens菌株（兩者間平均核苷酸一致性（ANI）為95.38%），表明同一宿主內(nèi)可共存同一屬的不同物種乃至不同菌株。Alpha多樣性（香農(nóng)指數(shù)）分析顯示，M. usitatus種群和Thrips屬物種的微生物組多樣性通常高于Aptinothrips rufus和Frankliniella屬物種。
關(guān)鍵共生菌的分離培養(yǎng)與基因組解析
為確認(rèn)上述細(xì)菌確實定植于薊馬腸道，研究從云南豆花薊馬腸道中分離培養(yǎng)出兩株優(yōu)勢細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA測序鑒定為Pantoea dispersa（菌株Mu-i0-P）和Serratia marcescens（菌株Mu-i1-S）。利用PacBio CLR技術(shù)對它們進行了全基因組測序。P. dispersa Mu-i0-P包含一條4.20 Mb的環(huán)狀染色體和三個質(zhì)粒，與從同一宿主宏基因組中組裝得到的MAG（MuY_m1_Pantoea）具有99.97%的ANI，證實了分離株與體內(nèi)共生菌的一致性。S. marcescens Mu-i1-S包含一條5.15 Mb的環(huán)狀染色體，與來自T. tabaci和T. hawaiiensis的MAGs具有超過99%的ANI。BUSCO評估顯示兩個分離株的基因組完整度均很高（P. dispersa: 98.4%， S. marcescens: 96.0%）。功能注釋表明，絕大多數(shù)預(yù)測的蛋白質(zhì)編碼基因在GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫中獲得了功能注釋。
系統(tǒng)發(fā)育與泛基因組分析揭示宿主適應(yīng)遺傳基礎(chǔ)
通過系統(tǒng)發(fā)育分析，將本研究分離的P. dispersa和S. marcescens菌株置于更廣泛的進化背景中。薊馬源P. dispersa與來自其他昆蟲（如Chinavia hilaris、Aedes albopictus）的菌株聚為一支。而薊馬源S. marcescens則與一些環(huán)境分離株聚在一起，提示其可能具有兼性共生或環(huán)境來源的特性。為探究宿主適應(yīng)性的遺傳機制，研究對P. dispersa和S. marcescens進行了泛基因組分析。根據(jù)NCBI BioSample的宿主信息，將菌株分為昆蟲、植物、環(huán)境、人類等關(guān)聯(lián)組。分析發(fā)現(xiàn)，兩個物種的泛基因組結(jié)構(gòu)相似，均呈現(xiàn)“小而保守的核心基因組+龐大可變的附屬基因組”模式。P. dispersa的核心基因組包含2827個基因簇，而附屬基因組（cloud, shell, soft-core）則包含10535個基因簇。S. marcescens的核心基因組包含2883個基因簇，附屬基因組包含13172個基因簇。系統(tǒng)發(fā)育樹與宿主關(guān)聯(lián)類別的疊加分析顯示，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與宿主類別之間存在復(fù)雜關(guān)聯(lián)，并非簡單對應(yīng)。利用Scoary工具進行關(guān)聯(lián)分析，在兩個物種中均發(fā)現(xiàn)昆蟲宿主關(guān)聯(lián)的菌株顯著富集了某些特定的功能基因，其中最突出的是水解酶（hydrolases）基因。在P. dispersa中還發(fā)現(xiàn)了與昆蟲宿主關(guān)聯(lián)的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，推測其可能與神經(jīng)毒性作用有關(guān)，共同暗示了這些附屬基因在幫助細(xì)菌適應(yīng)昆蟲宿主特定生態(tài)位中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。
討論與展望
本研究首次在約2億年的進化時間尺度上，對多種薊馬的微生物組進行了系統(tǒng)刻畫，揭示了其高度的異質(zhì)性和宿主特異性。微生物組的組成差異不僅存在于物種間，也存在于同一物種的不同地理種群（如M. usitatus的浙江種群攜帶Wolbachia，而云南、海南種群則無），暗示了環(huán)境暴露、食物來源等非遺傳因素的重要影響。研究建立并驗證了一個結(jié)合短讀長篩查與長讀長驗證的標(biāo)準(zhǔn)化分析流程，為未來相關(guān)研究提供了方法學(xué)參考。對P. dispersa和S. marcescens的高質(zhì)量基因組解析及比較基因組學(xué)分析，為理解昆蟲共生菌的宿主適應(yīng)機制提供了遺傳學(xué)見解。其龐大的附屬基因組及與昆蟲宿主關(guān)聯(lián)的特異性基因（如水解酶），可能是其成功定植并適應(yīng)多樣化昆蟲腸道環(huán)境的關(guān)鍵。這些發(fā)現(xiàn)不僅深化了對薊馬-微生物互作的認(rèn)識，也為利用微生物組進行害蟲生態(tài)防控策略的開發(fā)提供了新的潛在靶點和理論基礎(chǔ)。
