《Journal of Materials Chemistry B》：Controlled release of bone morphogenetic protein-2 improves motor function after traumatic brain injury in a rat model
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本文創新性地評估了一種由戊烯酸修飾的透明質酸(PHA)和巰基化失活肌腱(TDVT)構成的復合水凝膠，用于單階段治療創傷性腦損傷(TBI)大鼠模型。研究發現，該水凝膠前體具有滿足手術放置需求的屈服應力和回復性，并能與骨形態發生蛋白-2(BMP-2)微球控釋體系協同作用，顯著提升體外成骨分化指標。值得注意的是，盡管體內顱骨再生效果有限，但負載BMP-2微球的PHA-TDVT+μ100水凝膠意外地展現出顯著的神經保護作用，相比于陰性對照組，可使運動功能恢復指數提高2.8倍，大腦萎縮體積降低2.3倍。這揭示了BMP-2在促進骨再生之外，對腦損傷修復具有潛在應用價值，為開發既能修復顱骨缺損又能保護神經的單階段TBI治療方案提供了新思路。
引言
嚴重的創傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury, TBI）是一種危及生命的疾病，其特征是顱內腦腫脹。臨床上通常采用分兩階段的外科手術進行治療，即在初次手術中行去骨瓣減壓術（Decompressive Craniectomy, DC）以降低顱內壓，待腦腫脹消退后再行顱骨成形術。然而，兩階段手術之間的間隔期（數周至數月）可能導致大腦處于無保護狀態，引發被稱為“顱骨切除術后綜合征”（Syndrome of the Trephined, SOT）的神經并發癥。理想的治療方案是能通過單次手術同時處理腦損傷和顱骨缺損。水凝膠因其固有的柔韌性、可注射性和可控的藥物遞送能力，成為極具吸引力的單階段TBI治療候選材料。
本研究旨在評估一種由戊烯酸修飾的透明質酸（Pentenoate-Modified Hyaluronic Acid, PHA）聚合物與巰基化失活肌腱（Thiolated Devitalized Tendon, TDVT）顆粒通過硫醇-烯光聚合反應形成的復合水凝膠，在大鼠TBI模型中對顱骨再生的效果。此外，研究還探索了包裹了含骨形態發生蛋白-2（Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2）的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球的水凝膠，以期增強骨再生。研究的核心假設是，與對照組相比，控釋BMP-2的TDVT水凝膠能促進更佳的骨再生和運動功能恢復。
方法
材料制備
TDVT顆粒通過將豬跟腱組織低溫研磨、凍干后，與N-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫代乙酸酯反應并進行脫保護制得。PHA則通過對透明質酸與戊烯酸酐進行酯化反應合成。通過核磁共振氫譜和改良的Ellman實驗分別驗證了PHA的戊烯酸修飾和TDVT的巰基化。
水凝膠制備與表征
水凝膠前體由PHA、不同濃度（5%、10%、15%）的TDVT顆粒以及含有光引發劑和還原劑的PBS溶液混合而成。為研究BMP-2的控釋效應，制備了含有不同劑量（μ1, μ10, μ100，分別對應1, 10, 100 mg BMP-2微球/mL水凝膠）PLGA微球的水凝膠。水凝膠通過365nm紫外光照射1-2分鐘進行原位交聯。
通過流變學測試評估了水凝膠前體的屈服應力和儲能模量（G′）恢復率。對交聯后的水凝膠，則測定了其溶脹比、吸收率和壓縮模量，以評估其機械性能和體內保留能力。BMP-2從PLGA微球中的釋放動力學通過酶聯免疫吸附測定法（ELISA）在42天內進行評估。
體外細胞研究
將人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）接種于水凝膠盤上，在含或不含可溶性BMP-2的成骨誘導培養基中培養。通過鈣含量測定、骨鈣素（Osteocalcin, OCN）分泌量ELISA檢測以及逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）分析成骨相關基因（膠原蛋白Iα1鏈（COL1A1）、骨鈣素（OCN）、Runt相關轉錄因子2（RUNX2））的表達，以評估水凝膠的生物活性及與BMP-2的協同效應。
大鼠TBI模型與體內評估
建立大鼠TBI模型，在顱骨上制造一個8×5mm的矩形缺損，并使用受控皮質沖擊（Controlled Cortical Impact, CCI）裝置誘導腦損傷。實驗分組包括：僅DC（無TBI，陰性對照）、DC+TBI（無治療，陽性對照）、TBI封閉（DC+TBI后立即用牙科丙烯酸行顱骨成形術）、PHA水凝膠（材料對照）、PHA-TDVT水凝膠、PHA-TDVT+μ100水凝膠。
術后通過“熟練抓取測試”（Skilled Reach Test）每周評估大鼠的運動功能恢復情況，持續8周。10周后處死動物，取顱骨和腦組織進行分析。通過微型計算機斷層掃描（Micro-Computed Tomography, μCT）量化顱骨缺損區的新生骨體積，并評估大腦萎縮百分比。對顱骨樣本進行蘇木精-伊紅（H&E）染色，對腦組織樣本進行甲苯胺藍（Cresyl Violet）染色，進行組織學分析。
結果
水凝膠的機械性能表征
所有水凝膠前體配方均表現出可檢測的屈服應力，其中PHA-TDVT 15%組的屈服應力（1070±1.9 Pa）最高，并且所有前體的G′恢復率均超過80%。交聯后，隨著TDVT濃度的增加，水凝膠的平均溶脹比降低，而平均壓縮模量增加。PHA-TDVT 15%組的壓縮模量（200±80 kPa）顯著高于PHA組，滿足TBI治療應用所需的機械強度。
體外成骨活性
在hBMSCs體外培養實驗中，隨著TDVT濃度的增加，水凝膠組的鈣沉積和骨鈣素分泌呈上升趨勢。PHA-TDVT 15%組在含有可溶性BMP-2的培養基中表現出最高的鈣含量和骨鈣素分泌。BMP-2微球的加入進一步增強了成骨效應。含有最高濃度BMP-2微球（PHA-TDVT+μ100）的組別表現出最顯著的鈣沉積以及COL1A1、OCN和RUNX2基因的上調，其效果甚至超過了添加可溶性BMP-2的陽性對照組。
體內骨再生評估
令人意外的是，體內實驗結果顯示，所有實驗組（包括對照組）的顱骨缺損區新生骨體積均較低，且組間差異不顯著。μCT定量分析表明，PHA-TDVT+μ100組的新生骨體積平均值最低，甚至顯著低于單純的PHA組。H&E染色結果證實了所有組別均有從缺損邊緣向中心生長的新骨形成，未見壞死骨或明顯炎癥反應。
運動功能與神經保護效應
盡管骨再生效果有限，但運動功能測試結果揭示了BMP-2的顯著神經保護作用。在TBI后的8周恢復期內，所有TBI組大鼠的運動技能均出現不同程度受損，但PHA-TDVT+μ100組的恢復情況最佳。與DC+TBI對照組相比，PHA-TDVT+μ100組的8周累計熟練抓取指數高出2.8倍，表現出顯著更少的運動功能損傷。
大腦萎縮評估
μCT分析顯示，所有接受TBI的組別均出現了不同程度的大腦萎縮。其中，PHA-TDVT+μ100組的平均大腦萎縮百分比最低，與DC+TBI對照組相比降低了2.3倍，顯示出顯著的保護作用。甲苯胺藍染色結果與μCT數據一致，顯示PHA-TDVT+μ100組損傷部位的大腦皮層組織相對更為完整。
討論
本研究首次在大鼠TBI模型中評估了用于單階段治療的PHA-TDVT復合水凝膠。該水凝膠系統具有良好的手術可操作性、合適的機械性能和體外成骨活性，展現了其作為顱骨修復和TBI治療材料的潛力。
研究的一個核心發現是BMP-2在體內應用中的雙重角色悖論。盡管最初的假設是控釋BMP-2能促進骨再生，但體內實驗結果卻顯示其骨再生效果不佳，甚至可能因釋放時機、劑量或PLGA降解產物等因素而受到抑制。然而，一個意想不到且意義重大的發現是，BMP-2表現出了顯著的神經保護特性。PHA-TDVT+μ100水凝膠在并未顯著促進骨再生的前提下，有效改善了大鼠的運動功能恢復并減少了腦萎縮體積。
BMP-2的神經保護機制可能與其多效性有關。BMP-2及其受體在成年大腦中均有表達，可能通過影響血管內皮生長因子（VEGF）表達、神經干細胞分化、星形膠質細胞功能及極化等多個途徑，創造一個有利于神經保護和修復的微環境。BMP-2還被報道參與膠質瘢痕的形成，而反應性膠質增生可能在TBI后為繼發性損傷提供保護。
結論
本研究評估了負載BMP-2控釋微球的PHA-TDVT光交聯水凝膠在大鼠TBI模型中的治療效果。雖然該水凝膠在所有實驗組中引發的顱骨再生均有限，但其中負載高劑量BMP-2微球（PHA-TDVT+μ100）的組別，在改善運動功能損傷和減輕大腦萎縮方面展現出顯著優勢。這一發現揭示了BMP-2在治療TBI中作為神經保護劑的潛力，超越了其傳統促骨再生的角色。未來研究可探索BMP-2的雙重遞送策略，例如將一部分BMP-2結合在材料表面以促進骨再生，同時控釋另一部分以作用于腦組織修復，從而克服本研究中觀察到的局限，推動單階段TBI治療策略的發展。
