細胞轉染，即向細胞內導入遺傳物質以改變其功能的過程，在醫學領域有著廣泛的應用。傳統的化學和病毒載體遞送方法存在細胞毒性、成本高、免疫原性或遞送效率有限等問題。機械方法通過物理方式在細胞上產生開口以遞送貨物，成為了一種有前景的替代方案。然而，許多系統產生的細胞膜開口太小，無法遞送大分子貨物，或者打孔過程會導致細胞活力低下。本研究報道了一種創新的納米工程表面技術(NEST)設備，它集成了高深寬比的納米矛結構，能夠在高通量條件下可重復地穿孔細胞膜和核膜，實現直接的細胞核遞送。

NEST設備在微流控通道底部集成了尖銳的納米矛結構(高2 μm，長4 μm，尖端約100 nm寬，角度約40°)。當細胞懸浮液在壓力驅動下流經這些通道時，每個細胞會與一個納米矛接觸并被其穿刺。這種設計能精確地在細胞膜和核膜上產生足夠大的孔洞，以允許大分子貨物進入，同時確保細胞在治療后能夠恢復。為優化每個細胞類型的遞送效率和存活率，需針對不同細胞的大小調整微通道尺寸。共聚焦顯微鏡成像證實，處理后細胞膜和核膜上均出現了直徑約為7.4 μm和2.6 μm的孔洞，這為貨物直接進入細胞核提供了可視化的證據。

流體壓力是影響NEST設備打孔效果和細胞活力的關鍵參數。在HeLa細胞中，壓力優化為28 psi時，可在保持77%高存活率的同時，實現79%的3 kDa和70%的70 kDa葡聚糖遞送效率。在這種優化條件下，該設備能以極高的通量運行，理論上每分鐘可處理高達數千萬個細胞。雖然高細胞密度可能導致通道堵塞，但可通過分批處理和反向沖洗來維持高通量運作。

使用70 kDa的熒光標記葡聚糖(其流體力學半徑超過細胞核的被動滲透極限)進行遞送實驗。共聚焦顯微鏡圖像顯示，葡聚糖成功進入細胞質和核質，這直接證明了NEST設備不僅能穿孔細胞膜，還能穿透核膜，并允許大分子貨物通過擴散進入細胞核。這一能力是實現無需載體的核酸直接核遞送的基礎。

NEST設備在多種細胞類型中都展現出高效的胞內遞送能力。對于3 kDa的小葡聚糖，在CT26、HeLa、A20、Jurkat以及原代人類T細胞中，遞送效率均超過60%，在CT26細胞中甚至高達91%。特別值得注意的是，該設備對不同分子量(3 kDa、70 kDa、2000 kDa)葡聚糖的遞送效率差異不大，表明其遞送機制對貨物大小的依賴程度遠低于典型的基于擴散的方法。這主要歸因于NEST設備產生的孔洞遠大于大分子貨物的尺寸，使得中、大型貨物的遞送效率相近。

在基因轉染中，成功將質粒DNA遞送至細胞質并不保證蛋白表達，因為DNA需進入核內才能被轉錄。本研究證明，NEST設備能夠通過直接核膜穿孔，以超過60%的效率實現裸露質粒DNA的轉染。相比之下，化學載體聚乙烯亞胺(PEI)的轉染效率為48%，而沒有納米矛的對照NEST設備則幾乎無法實現轉染。動態表達分析顯示，NEST處理后僅1小時就能檢測到增強型綠色熒光蛋白(EGFP)信號，4小時內近50%的細胞已開始表達，而PEI轉染在12小時后才出現顯著的EGFP信號，脂質體轉染(Lipofectamine)和電穿孔(EP)也顯示出類似的延遲表達模式。NEST的表達動力學與顯微注射類似，表明其無需等待細胞分裂，而是通過機械穿孔直接實現了DNA的核內遞送，從而極大縮短了蛋白質表達的時間。

為了評估NEST處理對細胞的長期影響，研究檢測了細胞增殖和DNA損傷。結果表明，無論是否遞送質粒DNA，NEST處理后的HeLa細胞在7天內均保持了正常的指數生長速率。在DNA損傷方面，采用商業化試劑盒檢測DNA雙鏈斷裂后的組蛋白募集，結果顯示NEST處理組與未經處理的對照組之間無統計學顯著差異，損傷細胞比例均低于5%。此外，膜修復實驗證實，約50%的細胞在治療后1分鐘內恢復，90%在10分鐘內恢復。這些數據共同表明NEST處理在實現高效遞送的同時，能較好地維持細胞的生理功能和基因組穩定性。

核膜孔道化是實現外源質粒DNA快速表達的關鍵策略。NEST技術通過機械方式精確控制核膜穿孔，解決了化學轉染依賴細胞周期、非核靶向方法表達慢的瓶頸。與同樣能實現核遞送的基于電穿孔的DFE設備相比，NEST設備雖在某些遞送效率上略低，但其非電穿孔機制對某些對電刺激敏感的細胞(如原代免疫細胞)更具優勢，且能產生更大的孔洞，更適用于遞送微米級顆粒、大型蛋白質復合體或DNA折紙結構等大尺寸貨物。其獨特的高通量、無載體遞送特性，使其在快速生產基因工程細胞方面展現出巨大潛力，尤其是在需要高效遞送的CAR-T細胞療法或誘導多能干細胞重編程等治療應用領域。

綜上所述，NEST設備通過機械穿孔同時破壞細胞膜和核膜，實現了高通量、高效率的無載體基因遞送，并以接近顯微注射的速度啟動了蛋白質表達，同時保持了較高的細胞活力和正常的細胞生理功能。這項技術為治療疑難雜癥的工程化活細胞的制造提供了新的工具和視角。