柑橘黃龍病（Huanglongbing, HLB），又稱柑橘黃龍病，是由韌皮部定殖細菌“CandidatusLiberibacter asiaticus”（CLas）引起的毀滅性病害，對全球柑橘產業構成嚴重威脅。該病原體主要由亞洲柑橘木虱（Diaphorina citri）以持久增殖型方式傳播。當前，由于CLas難以培養及病害系統的復雜性，HLB的防控面臨巨大挑戰。以往研究多集中于開發植物源抗菌肽、噬菌體內溶素等植物層面的防控策略，而媒介昆蟲先天免疫系統在限制CLas傳播中的作用則相對未被充分探索。在木虱體內，CLas的持久傳播涉及病原體與媒介之間復雜的互作，其過程包括在中腸的初始定殖、進入血淋巴的擴散以及最終入侵唾液腺。已知CLas能劫持木虱的細胞骨架蛋白以突破中腸屏障，同時也會觸發木虱的免疫反應。近期研究強調了蛋白酶在動植物宿主-病原體互作中的重要性。組織蛋白酶（Cathepsins）是一類半胱氨酸蛋白酶，通過蛋白水解切割靶標蛋白發揮功能，其活性依賴于保守的催化三聯體（Cys, His, Asn）。在柑橘中，木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（Papain-like cysteine proteases, PLCPs）在CLas感染后上調并有助于宿主防御。然而，CLas也能分泌毒力因子抑制柑橘PLCP的活性。在昆蟲媒介中，木虱的組織蛋白酶L（CTSL）是否能直接通過蛋白水解切割來降解CLas尚屬未知。革蘭氏陰性菌的外膜蛋白是抗菌干預的誘人靶點，其中BamD是β-桶狀組裝機制復合物的核心組分，對大多數革蘭氏陰性菌的外膜蛋白折疊和插入至關重要且高度保守。本研究旨在探索木虱半胱氨酸組織蛋白酶是否以及如何作為免疫效應因子直接靶向CLas的外膜蛋白。

為探究亞洲柑橘木虱的DcCTSLs是否參與對CLas的免疫互作，研究通過生物信息學分析鑒定出9個編碼CTSL的基因。與其它昆蟲的CTSLs類似，DcCTSLs包含N端信號肽、自抑制前肽區域以及具有半胱氨酸蛋白酶特征性催化三聯體（Cys, His, Asn）的C端Peptidase C1結構域。酶活檢測表明，CLas感染后木虱體內總組織蛋白酶活性顯著升高。向感染木虱體內顯微注射組織蛋白酶抑制劑E64會降低酶活并增加CLas 16S rRNA水平，提示組織蛋白酶活性有助于防御CLas。通過RT-qPCR比較CLas感染與未感染木虱中CTSL基因的表達水平，發現DcCTSL1和DcCTSL2顯著上調，其中DcCTSL1上調最顯著，其蛋白酶前體（PreP，~40 kDa）和成熟蛋白酶（MP，~25 kDa）形式的蛋白水平也顯著增加。利用RNAi敲低DcCTSL1表達會導致CLas積累顯著增加、總組織蛋白酶活性降低以及受感染木虱的CLas傳播效率增強，而敲低DcCTSL2無顯著影響，這些結果證明DcCTSL1對木虱的抗CLas免疫至關重要。

DcCTSL1的無活性蛋白酶形式包含抑制因子結構域和Peptidase C1結構域，而其MP形式僅保留包含特征性催化三聯體的Peptidase C1結構域。酶活實驗證實純化的DcCTSL1-MP具有高蛋白水解活性。考慮到半胱氨酸蛋白酶具有催化切割活性，研究以DcCTSL1為誘餌，對一組19個CLas膜相關蛋白進行了酵母雙雜交篩選。在所有候選蛋白中，只有BamD與DcCTSL1，特別是與其成熟的Peptidase C1結構域發生互作。該互作進一步通過GST pull-down實驗得到驗證。免疫熒光標記顯示，在未感染木虱的中腸細胞中，DcCTSL1呈細胞質分布；而在感染木虱的中腸細胞中，DcCTSL1大量富集并與CLas的BamD共定位。免疫電鏡進一步顯示，在感染木虱的中腸細胞中，BamD特異性定位于CLas細胞的膜上，而DcCTSL1則在CLas細胞和鄰近的包涵體上均有檢測到。BamD是參與細菌外膜完整性和組裝的必需外膜蛋白。系統發育分析表明BamD在韌皮部限制性細菌中廣泛保守。這些發現表明DcCTSL1直接結合CLas外膜蛋白BamD并有助于其抗菌活性。

接下來，研究探究了DcCTSL1的抗CLas免疫機制。向CLas感染木虱體內顯微注射純化的DcCTSL1-MP，會導致全長BamD條帶（~30 kDa）減少，并出現一條更強的~18 kDa條帶。相反，通過dsRNA敲低DcCTSL1表達則導致30 kDa條帶強度增加，切割減少。免疫電鏡也揭示，用DcCTSL1-MP處理感染木虱的中腸細胞后，細菌細胞膜受損。定量分析顯示，DcCTSL1-MP處理導致約50%的CLas細胞膜受損，而BSA處理的對照組僅為約5%。鑒于DcCTSL1特異性結合CLas且其外源施用顯著增加CLas膜損傷，研究得出結論：DcCTSL1與BamD的特異性互作導致膜破壞，這是其抗CLas活性的關鍵機制。

為深入研究DcCTSL1-MP如何直接切割BamD，將純化的DcCTSL1-MP與BamD在37°C孵育4小時。SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色顯示30 kDa的BamD條帶減少，并出現約18 kDa和12 kDa的兩個切割產物，表明DcCTSL1-MP直接對BamD進行了蛋白水解切割。同樣，在共表達DcCTSL1-MP和BamD的HEK-293T細胞中，Western blot分析顯示隨著DcCTSL1-MP積累水平升高，BamD切割增加。為確定精確切割位點，從SDS-PAGE膠上切下約12 kDa的C端片段，進行胰蛋白酶消化和質譜分析。來自切割產物的第一個可識別肽段表明切割發生在BamD的Arg¹⁴⁶和Asp¹⁴⁷之間。序列分析顯示，R¹⁴⁶之前是一個疏水殘基Ile¹⁴⁵，這與報道的半胱氨酸組織蛋白酶對P1位點為精氨酸、P2位點為疏水或芳香族殘基的底物偏好一致。為進一步探究BamD中I¹⁴⁵、R¹⁴⁶和D¹⁴⁷在DcCTSL1-MP介導切割中的作用，在這些位點及相鄰的Met¹⁴⁴處引入了丙氨酸取代。丙氨酸突變顯示，I¹⁴⁵和R¹⁴⁶的取代完全消除了BamD的切割，而M¹⁴⁴或D¹⁴⁷的突變則沒有影響。這些結果證明BamD中的I¹⁴⁵和R¹⁴⁶是DcCTSL1識別底物的關鍵，蛋白水解切割特異性地發生在R¹⁴⁶和D¹⁴⁷之間。

序列比對揭示了IR基序在不可培養的Liberibacter物種BamD蛋白中的保守性，而在可培養的Liberibacter crescensBamD中該基序缺失。值得注意的是，利用AlphaFold3進行的結構預測表明，CLas BamD的I¹⁴⁵和R¹⁴⁶殘基位于暴露在蛋白質表面的柔性連接區，提示它們可能作為蛋白酶切割位點而被訪問。因此，研究得出結論：DcCTSL1通過特異性蛋白-蛋白互作靶向BamD，隨后識別表面暴露的IR基序，并切割IR基序的R¹⁴⁶與下游D¹⁴⁷殘基之間的肽鍵。

半胱氨酸組織蛋白酶的酶活依賴于由Cys、His和Asn組成的保守催化三聯體。作為該家族成員，DcCTSL1包含特征性的三聯體殘基C¹⁸⁵、H³²⁵和N³⁵⁰。為確定DcCTSL1介導的BamD切割是否需要此三聯體，研究構建了丙氨酸取代突變體。所有純化的突變體蛋白在體外均顯示出比野生型顯著降低的酶活。隨后，將每種純化的DcCTSL1-MP突變體顯微注射到CLas感染木虱體內。Western blot分析顯示，與注射野生型DcCTSL1-MP的木虱相比，突變體處理組中~30 kDa的全長BamD條帶更強，而~18 kDa的切割片段更弱。此外，當在HEK-293T細胞中與BamD共表達時，野生型DcCTSL1-MP能有效切割BamD，而所有三個催化三聯體突變體均喪失了此能力。為表征DcCTSL1的酶學特性，系統評估了pH對其切割底物BamD的蛋白水解活性的影響。在pH梯度從3.5到11.5的緩沖液中，將純化的重組DcCTSL1-MP與BamD在37°C孵育4小時。對切割產物的定量分析顯示，DcCTSL1-MP在pH 5.5時表現出最大的蛋白水解活性。在酸性（pH 3.5）和近中性（pH 7.5）條件下也保留了顯著活性，而在堿性條件下（pH 9.5和11.5）則幾乎觀察不到切割。這些結果表明，DcCTSL1介導的對CLas外膜蛋白BamD的切割功能上依賴于其保守的催化三聯體。這種蛋白水解活性破壞了細菌膜的完整性，最終遏制了CLas的增殖。

為評估DcCTSL1對HLB的抗菌功效，首先通過農桿菌介導的瞬時表達在CLas感染柑橘植株的葉片中表達DcCTSL1-MP。qPCR和Western blot分析顯示，與對照相比，表達DcCTSL1-MP的葉片中CLas滴度顯著降低，CLas外膜蛋白Barrel和BamD水平下降，BamD切割產物積累增加。這可能意味著DcCTSL1破壞了CLas膜的完整性并誘導了細胞裂解效應。

為穩定表達DcCTSL1，通過發根農桿菌介導的轉化，利用CLas感染檸檬枝條的莖段產生了轉基因根。通過GUS染色和Western blot驗證了轉基因根。qPCR分析顯示，與空載對照相比，過表達DcCTSL1的根中CLas滴度顯著降低。與此結果一致，Western blot分析顯示過表達DcCTSL1的根中Barrel和BamD水平降低，同時BamD切割增加。這些結果表明，異源表達DcCTSL1能有效抑制植株體內的CLas感染。

接下來，研究生產并純化了重組DcCTSL1-MP蛋白以評估其用于HLB防控的潛力。植物毒性測試表明，即使在高濃度下，將DcCTSL1-MP注射到柑橘葉片中也未造成可見損傷。為評估其保護功效，將DcCTSL1-MP或作為對照的BSA注射到CLas感染甜橙樹的莖干中。注射后兩個月，用DcCTSL1-MP處理的樹生長改善，且與CLas滴度持續增加的BSA注射對照相比，其CLas滴度顯著降低。總之，通過多種實驗方法，包括瞬時表達、穩定根轉化和直接蛋白施用，研究證明DcCTSL1在柑橘植株中發揮強大的抗CLas活性，突顯了其作為HLB管理治療劑的潛力。

基于半胱氨酸蛋白酶在哺乳動物、昆蟲和植物中的高度保守性，以及現有證據表明柑橘PLCPs有助于對CLas的免疫反應，研究探討了甜橙CsPLCP是否也通過蛋白水解切割CLas BamD來賦予抗CLas活性。值得注意的是，CsPLCP和DcCTSL1具有保守的催化殘基，它們的成熟蛋白酶結構域具有58%的氨基酸序列同一性。對總CsPLCP活性的測量顯示，與健康對照相比，CLas感染柑橘葉片中的活性被顯著誘導。CsPLCP的轉錄水平在CLas感染后上調。相應地，其蛋白酶前體和成熟蛋白酶形式的蛋白水平均增加，同時伴有BamD切割產物的積累，表明在柑橘響應CLas感染時也發生了BamD的蛋白水解加工。

利用酵母雙雜交實驗，證實了全長CsPLCP及其成熟形式均與BamD互作。為確定植株體內的空間關系，對CLas感染柑橘葉片組織進行了免疫電鏡觀察。結果顯示，在感染韌皮部組織內，CsPLCP和BamD特異性定位于CLas細胞膜周圍。CsPLCP包含保守的催化三聯體殘基C¹⁵²、H²⁸⁶和N³⁰⁷。為評估BamD的蛋白水解切割是否依賴此催化三聯體，構建了丙氨酸取代突變體。在HEK-293T細胞中共表達野生型CsPLCP-MP與BamD導致有效切割，而所有三個催化突變體均喪失了此蛋白水解活性，證明CsPLCP介導的切割嚴格依賴于其功能性催化三聯體。

為比較木虱蛋白酶DcCTSL1和柑橘蛋白酶CsPLCP在切割BamD和抑制CLas方面的活性，首先測量了它們各自重組MP結構域的蛋白酶活性。在相同濃度下，DcCTSL1-MP在體外表現出比CsPLCP-MP更高的蛋白水解活性。當與BamD在37°C孵育4小時，兩種蛋白酶都切割了BamD，不過DcCTSL1-MP顯示出更強的切割活性。通過農桿菌浸潤在CLas感染柑橘植株葉片中瞬時表達兩種蛋白酶，進一步評估了CsPLCP-MP的抗CLas能力并與DcCTSL1-MP進行了比較。qPCR分析顯示，表達CsPLCP-MP顯著降低了CLas滴度，而DcCTSL1-MP導致更大幅度的降低。與此一致，兩種蛋白酶都降低了CLas外膜蛋白Barrel和BamD的積累，并增加了BamD切割產物的水平。然而，與qPCR結果相對應，DcCTSL1-MP的表達導致比CsPLCP-MP更低的總體CLas膜蛋白水平和更豐富的BamD切割產物。這些結果表明，CsPLCP和DcCTSL1都通過切割BamD發揮抗CLas活性，其中DcCTSL1表現出更強的蛋白酶活性和對CLas更大的抑制作用。

對抗HLB的持續斗爭推