《Marine Mammal Science》：Correcting Lipid Extraction Effects on Nitrogen Isotopic Values (δ15N) in Cetacean Skin
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本文通過近900個五種鯨類的皮膚樣本，系統評估了脂質提取（Folch法）對δ15N值的富集效應，并建立了跨物種的線性校正模型。研究證實，脂質提取會導致δ15N值平均升高0.29‰，其影響存在個體差異，可能干擾營養級關系解讀。所提出的物種特異性與全局數學模型可精準預測未提取樣本的δ15NNE值，為歷史樣本校正及小樣本量研究提供了高效、低成本的解決方案，尤其適用于原料缺失的回顧性研究。
文章內容歸納總結
引言
穩定同位素生物標志物是研究野生動物攝食生態與營養生態位的重要工具，其中碳(δ13C)和氮(δ15N)穩定同位素比值可提供關于碳源、棲息地利用、營養關系及飲食組成的信息。皮膚活檢因其易于從自由活動的動物獲取，已被廣泛用于鯨類的穩定同位素研究。皮膚是代謝活躍的組織，其表皮含有豐富的角質蛋白，能夠整合采樣前數月的飲食信息，但同時也含有相當量的脂質。由于脂質相對于蛋白質和碳水化合物組分貧化13C，高脂質含量可能對δ13C值及其在評估飲食組成和營養關系時的解讀產生負向偏差。因此，在δ13C分析前進行脂質提取已成為常規操作。
過去，通常假定脂質的化學提取不影響δ15N值，并常從同一份脂質提取后的等分樣品中進行δ13C和δ15N分析。然而，多項對不同物種和組織的研究已記錄脂質提取后會導致15N顯著富集，這可能源于提取過程中特定氨基酸的流失以及貧15N的含氮廢物的共淋洗。因此，目前推薦的方法是從脂質提取(LE)的等分樣品估算δ13C，從未提取(NE)的整體樣品獲取δ15N。但這種方法不僅成本高、耗時且勞動密集，在活檢樣本量小或需進行其他類型分析時可能不可行或并非最優選擇。
利用數學模型從脂質提取后的樣品(δ15NLE)校正恢復未提取樣品的δ15N值(δ15NNE)已被證明是多種脊椎動物類群的可靠選擇。這種方法對于追溯性校正現有脂質提取樣品（其原始材料可能已不存在）尤為有用。本研究基于Lesage等人的工作，大幅擴展了樣本量，旨在評估脂質提取對五種鯨類皮膚δ15N值的影響，并提出并驗證物種特異性和多物種（全局）數學模型，以從脂質提取樣品中估算δ15NNE值。
方法
研究使用了1998年至2023年間在加拿大圣勞倫斯河口和海灣收集的863個皮膚樣品，涉及白鯨、藍鯨、小須鯨、長須鯨和座頭鯨五種物種。樣品來自尸體監測計劃或遠程活檢采樣。所有樣品的表皮均與真皮及下層脂肪分離，凍干并研磨成細粉，然后分成兩份等分樣品。一份不進行任何處理，另一份使用Folch法進行脂質提取。
碳氮穩定同位素使用元素分析儀耦合同位素比質譜儀進行測量。同位素豐度以δ表示法表示，儀器精度對δ13C為±0.2‰，對δ15N為±0.3‰。通過隨機重復分析估計的樣品精度平均差異為δ13C 0.1‰，δ15N 0.2‰。
脂質提取對δ15N值的影響計算為脂質提取與未提取等分樣品之間的差值(ΔN)。使用置換多元方差分析比較物種間及樣品來源間的差異。評估了采樣日期對ΔN、未提取樣品碳氮比(CNNE)和提取后碳氮比(CNLE)的影響。為預測δ15NNE，開發了包含所有物種的全局模型和每個物種的特定模型，候選模型包括是否使用δ15NLE和CNLE作為協變量，以及是否將采樣年份作為隨機因子。通過均方根誤差、平均絕對誤差和R平方系數評估模型性能。最后，使用來自同一或其他環境的另外三個物種（港灣鼠海豚、北極白鯨、虎鯨）的數據集驗證了全局模型和特定物種模型的可推廣性。
結果
脂質提取對δ15N值的影響
脂質提取對所有物種的δ15N值均有影響，導致整體平均15N富集0.29‰ ± 0.41‰，這相當于基于實驗室標準的儀器精度上限(±0.3‰)。然而，所有物種合并時有33.7%的樣品超出了此范圍。除藍鯨外，脂質提取對δ15N的平均影響在所有物種中相似，藍鯨的ΔN顯著更高，為0.40‰。脂質提取的效果不因樣品是通過自由活動動物活檢還是尸體采集而不同。未檢測到樣本量對ΔN變異有顯著影響。
CNNE、CNLE和ΔN值的時間趨勢
各物種在ΔN值、CNLE或CNNE隨時間變化方面未檢測到一致的模式，且通常只有相對較小部分的方差或偏差可由線性或非線性模型解釋。座頭鯨在所有三個變量中均檢測到正向時間趨勢，小須鯨的ΔN和CNNE隨時間線性下降，白鯨的CNLE隨時間下降，長須鯨的ΔN隨時間線性增加。
脂質標準化模型
無論考慮所有物種還是單個物種，最擬合數據的模型始終僅包含變量δ15NLE。將CNLE作為協變量并未改善任何模型的擬合度。然而，將采樣年份作為隨機因子與δ15NLE一同納入，確實改善了座頭鯨的模型擬合度，盡管相關的解釋偏差增加有限。
模型性能
全局模型和物種特異性模型均能以高精度從δ15NLE預測δ15NNE，預測值與觀測值之間的平均差異接近于零。總體而言，74%（全局模型）和超過76%（物種特異性模型）的預測值落在儀器精度范圍(±0.3‰)內。然而，對于北極白鯨，全局模型比物種特異性模型更準確。
使用全局模型預測港灣鼠海豚的δ15NNE，結果90%的預測值與觀測值差異落在儀器精度內。但對于虎鯨和北極白鯨，模型性能較差，分別只有67%和44%的預測值在儀器精度內。使用白鯨特異性模型并未改善對北極白鯨的預測。
討論
脂質提取對δ15N值的影響
本研究記錄了所有測試鯨類物種在脂質提取后均出現顯著的15N富集。平均富集水平接近基于內標的典型儀器精度(±0.3‰)。然而，脂質提取的效果在個體間差異很大，在某些情況下可能大到足以改變對營養關系、營養級位置或使用同位素混合模型的飲食估算的解讀。脂質去除的效果在物種間也不均勻，即使是近緣物種。鑒于所有樣品均使用相同的Folch程序進行脂質提取，觀察到的變異很可能源于物種間皮膚組成的差異。從進化角度看，水生皮膚適應在不同鯨類物種中獨立演化，皮膚結構和厚度的差異可能導致處理過程中的變異。脂質提取被認為通過溶解作用改變δ15N值，即溶劑對氨基酸的提取或共提取。因此，脂質提取對δ15N值的影響取決于所用溶劑的極性和使用方法。
脂質標準化模型
全局模型和物種特異性模型均能以高精度從皮膚樣品的δ15NLE值預測δ15NNE值。與模型預測相關的平均誤差與基于實驗室標準的儀器精度相當。數學模型校正的有用性在很大程度上取決于其相對于傳統方法（對δ13C和δ15N使用單獨等分樣品進行分析）的精確度和準確度。在潛在獵物源δ15N值差異較大的系統中，全局模型預測引入的誤差平均小于獵物源間觀測δ15N梯度的1%，在最極端情況下可達40%。在這種情況下，建模方法不太可能顯著影響飲食估算或營養關系的結果。在獵物差異很小且需要更高精度的系統中，則可能需要對單獨等分樣品進行分析，以將分析誤差控制在至少比自然同位素景觀變異低三倍的水平。
全局模型成功擴展到同樣在圣勞倫斯生態系統取樣的港灣鼠海豚，表明該模型很可能可以放心地用于該地區的其他鯨類物種。當擴展到在北極取樣的動物時，EGSL全局模型性能的下降，以及這可能源于暴露于不同環境條件的可能性，值得進一步分析。盡管如此，全局模型對北極白鯨和虎鯨仍然相對有效，使其在缺乏物種特異性模型時成為一個潛在可接受的選擇。
結論
本研究證實，脂質提取對五種鯨類皮膚δ15N值具有不可忽視的影響，并提供了物種特異性和多物種模型，用于從脂質提取樣品中可靠地預測整體δ15N值。所提出的數學校正為元素特異性同位素分析提供了一種經濟高效的替代方案，并為追溯性校正原始材料可能已不存在的現有脂質提取樣品提供了有價值的工具。在數學模型校正與對兩種化學元素使用單獨等分樣品進行分析之間的最終選擇，可能取決于獵物同位素景觀的變異以及解決研究問題所需的分辨率。
