《Sustainable Food Technology》：Colored avocado (Persea americana Mill.) seed extract using a natural deep eutectic solvent for potential sustainable food coloring applications: towards a circular bioeconomy
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本文綜述了利用天然低共熔溶劑（NADES）從牛油果籽中綠色提取有色化合物（CASE）的研究。研究表明，甘油:乙酸鈉（Gly:NaOAc, 3:1）NADES能高效提取出高得率、富含多酚、具有抗氧化活性且無細胞毒性的CASE，其pH依賴的顯色特性與穩定性使其有望成為合成橙紅色食品著色劑的可持續替代品，契合循環生物經濟理念。
1引言
牛油果（Persea americanaMill.）的全球消費與產量持續增長，預計到2030年全球產量將達到1200萬噸。這一增長產生了大量的農業工業殘留物，主要是果核和果皮，這些廢棄物如不妥善處理會帶來環境問題，但其本身也是生物活性化合物的豐富來源。通過級聯生物精煉和綠色加工方法對這些副產物進行增值化利用，支持高附加值生物產品的可持續生產，并促進循環生物經濟的發展。本研究探索了從牛油果籽中提取天然著色劑，作為合成橙紅色食品著色劑的潛在環保替代品。使用熱蒸餾水、70%乙醇（回流）以及甘油:乙酸鈉（Gly:NaOAc, 3:1）天然低共熔溶劑（NADES）從Fuerte和Hass品種的牛油果籽中制備了有色牛油果籽提取物（CASEs）。在提取前，將籽漿暴露在空氣中35分鐘，以促使多酚氧化酶（PPO）介導的顏色形成。水提和醇提得到了干燥粉末，而Gly:NaOAc (3:1) NADES則產生了一種穩定的、即用型液態CASE/NADES，其得率（以最終液體系統質量相對于初始干籽質量計算）很高（Hass為88.6%，Fuerte為88.2%）。CASEs在480 nm處有最大吸光度，并用檸檬黃當量進行定量。CASE/Gly:NaOAc NADES配方在pH 3-7范圍內表現出pH依賴的顏色穩定性，并在不同儲存和光照條件下保持了色彩完整性。以μmol銅還原當量（CRE）每毫升表示的抗氧化能力，在乙醇提取物中最高（Fuerte品種為3980.33，Hass品種為1980.33），其次是NADES提取物，分別為934.61和736.56 CRE每毫升。CASE/(Gly:NaOAc 3:1) 體系在堿性條件下顏色加深，在光照和黑暗儲存條件下均保持穩定。當使用Gly:NaOAc (3:1) NADES提取時，總酚含量（TPC）達到Hass品種203.45 mg GAE/100g鮮重和Fuerte品種171.92 mg GAE/100g鮮重。對人皮膚成纖維細胞的細胞毒性試驗（MTT法）證實，CASE/(Gly:NaOAc) 3:1 NADES體系無毒，可能適合作為天然食品著色替代品。將牛油果籽綠色增值轉化為功能性著色劑，為減少廢物、開發生物產品和建立新的工業價值鏈提供了一條有前景的途徑，支持了韌性循環生物經濟的推進。
2材料與方法
2.1材料與試劑
實驗使用來自厄瓜多爾的Hass和Fuerte品種牛油果。所有提取制備用試劑均為食品級。甘油、乙醇、乙酸鈉和氯化膽堿等購自指定供應商。抗氧化活性測定使用商業OxiSelect? TAC試劑盒。總多酚測定使用Folin–Ciocalteu試劑、碳酸鈉和沒食子酸。
2.2牛油果籽選擇、Gly/NaOAc 3:1 NADES合成與提取制備
牛油果經清洗、去核、切塊后，與0.7體積蒸餾水混合打成均勻籽漿。將籽漿鋪開（約1 cm厚）并在空氣中靜置35分鐘，以激活多酚氧化酶（PPO）促發顏色形成。隨后使用蒸餾水、70%乙醇和Gly/NaOAc (3:1) NADES三種溶劑進行CASE提取。水提和醇提采用加熱（70 °C, 120 min）后濃縮干燥得粉末。NADES的合成按文獻方法將甘油與乙酸鈉按3:1摩爾比在70 °C下攪拌加熱45分鐘制得澄清液體，使用時用水稀釋至90%（v/v）。NADES提取采用滲濾法，條件與水/醇提相同（70-80 °C水浴，120 min）。提取后混合物經真空過濾、離心，上清液即為CASE/NADES即用液體提取物。提取得率計算方式不同：水/醇提為干燥粉末質量與所用牛油果籽質量之比；NADES提為上清液中回收的CASE/NADES液體部分質量與初始牛油果籽漿質量之比。為進行光譜分析，NADES提取物用蒸餾水按2:1（v/v）稀釋以降低粘度。
2.3多酚含量測定
采用Folin–Ciocalteu法測定總多酚含量。將稀釋的提取物與試劑混合，加入碳酸鈉溶液，孵育2小時后在760 nm測吸光度。使用沒食子酸溶液制作標準曲線，結果以沒食子酸當量（GAE）表示。
2.4總抗氧化能力
使用“OxiSelect? TAC”試劑盒，按照說明書通過比色法測定總抗氧化能力。樣品在測定前離心并于4 °C儲存24小時。在490 nm測量吸光度，并使用尿酸標準品制作標準曲線。
2.5動力學、pH與穩定性
2.5.1動力學
為評估顯色動力學，將牛油果籽漿在提取前暴露于空氣不同時間（0.5 至 40 分鐘）。隨后進行提取，將所得上清液離心、稀釋，在480 nm記錄吸光度。該動力學分析專門對應于籽漿的空氣暴露期（與PPO介導的氧化相關），而非提取過程本身。
2.5.2pH依賴性顏色響應
為確保可比性，所有CASE樣品在pH調整前均通過稀釋歸一化至相同的初始吸光度（A480= 0.30 ± 0.02）。將歸一化后的CASE溶液與不同pH值（2, 4, 6, 7, 9, 10）的PBS緩沖液按2:1體積比混合，離心后在480 nm記錄其吸收光譜。
2.5.3穩定性測定
對于穩定性測試，所有提取物同樣在PBS（pH 7.5）中歸一化至A480= 0.30 ± 0.02（第0天）。樣品在密封管中于不同溫度（4 °C和25 °C）和光照條件（明/暗）下儲存。在15天內每日測量吸光度，結果以A/A0表示，其中A0為第0天歸一化樣品的吸光度。
2.6細胞毒性評估
評估了水提和醇提CASEs對兩種牛油果品種的細胞毒性，而CASE/Gly/NaOAc (3:1) NADES體系僅針對在全球商業中占主導地位的Hass品種進行了測試。用含有不同濃度CASEs（5 至 0.0005 mg mL-1）的培養液處理從人皮膚活檢中分離的原代成纖維細胞。通過MTT法評估處理24小時和48小時后的細胞活力。所有測定均進行五重復。
2.7CASE/Gly:NaOAc NADES體系作為天然著色劑在酸奶中的應用評估
進行了初步實驗，評估CASE/Gly:NaOAc NADES體系作為即用型天然著色劑在乳制品中的應用潛力。向三種商業品牌天然酸奶中各加入1 mL該CASE/NADES體系至100 mL酸奶中，輕柔混合至顏色分布均勻。以未處理的同品牌酸奶作為對照，評估顏色變化。所有酸奶樣品用蒸餾水1:10（v/v）稀釋以降低濁度，離心取上清液，在400-700 nm范圍內記錄可見吸收光譜，以確定最大吸收波長并評估顏色變化。同時測量了樣品的密度和pH。
2.8統計分析
所有定量變量（得率、吸光度、濃度、抗氧化能力）均采用雙因素實驗設計進行評估。固定因素為溶劑和牛油果品種，每個處理三個重復。數據在滿足正態性和方差齊性假設后，進行雙因素方差分析，若存在顯著差異則使用Tukey's HSD檢驗進行兩兩比較。穩定性數據因不滿足參數檢驗假設，使用Kruskal-Wallis檢驗評估差異。所有分析在Minitab? 19.1中進行。
3結果與討論
3.1提取得率
視覺上，水提CASEs呈透明橙色，醇提CASE顏色更濃，呈更強烈的橙色，而CASE/Gly:NaOAc (3:1) NADES體系則呈現鮮艷的紅橙色。方差分析顯示溶劑類型對CASE得率有顯著影響，而品種間無統計學差異。Tukey檢驗將樣品分為三個顯著不同的組：A組（得率最高），使用Gly/NaOAc (3:1) NADES滲濾提取（Hass 88.6%；Fuerte 88.2%）；B組，70%乙醇回流提取（Hass 19.0%；Fuerte 13.0%）；C組，70 °C熱蒸餾水提取（Hass 8.0%；Fuerte 2.6%）。NADES體系的高得率歸因于形成了高濃度的CASE/NADES液體體系，無需干燥或濃縮，可直接作為即用產品。在480 nm處的吸光度（作為顏色強度的定性指標）也顯示顯著差異，NADES和醇提的吸光度最高，水提最低。需注意，圖中吸光度值反映的是各提取體系工作濃度下的顏色強度，并非用于溶劑間定量比較提取效率，提取效率基于重量得率和校準的CASE濃度進行評估。
3.2紅橙色CASEs的濃度
CASEs的顏色濃度通過紫外-可見分光光度法測定。所有樣品在480 nm處均有最大吸收峰。使用檸檬黃校準曲線在480 nm進行定量分析，結果以檸檬黃當量（ppm）表示。在70%乙醇提取物中，Hass品種濃度為2210 ppm，Fuerte為1310 ppm。使用Gly:NaOAc (3:1) NADES提取的CASE在Hass品種中表現出更高的吸光度（0.460），超過了水提和醇提CASEs。統計分析證實，品種間和溶劑間均存在顯著差異。Hass品種的CASEs濃度高于Fuerte品種，而Gly:NaOAc (3:1) NADES與70%乙醇和蒸餾水有顯著差異，后兩者間無顯著差異。NADES提取物濃度性能增強可能歸因于其略帶堿性的pH、相對于純甘油降低的粘度、以及有利的極性-溶解度平衡。雖然本研究未分離純化色素，但已有文獻從CASE中分離出分子式為C29H30O14的糖基化苯并卓酚酮衍生物作為主要黃橙色固體色素。
3.3動力學、pH與穩定性
牛油果籽中PPO的活性是其在氧氣存在下氧化形成特征性紅橙色的原因。動力學分析顯示，牛油果籽漿暴露于空氣的時間越長，橙色顯色強度越高。CASE/Gly:NaOAc (3:1) NADES體系在空氣暴露初期（2-5分鐘內）吸光度增加更快，而乙醇體系則表現為更緩慢的初始上升和更漸進的進程。這表明NADES介質在提取階段能更快地穩定和增溶氧化產生的發色中間體，而非改變了PPO的反應動力學本身。隨著pH從2升高到10，CASE在480 nm處的吸光度逐漸上升。視覺上，CASE在酸性pH 2-6時呈淡黃橙色，在中性pH 7-8時呈亮橙粉色，在堿性pH 9-11時呈深紅橙色。CASE/Gly:NaOAc NADES體系在pH 2-8范圍內的吸光度增長較為平緩，這可能是由于乙酸鈉的緩沖效應和NADES的高粘度減緩了反應動力學。這些結果表明CASE/Gly:NaOAc NADES體系的著色與花色苷無關，因為花色苷在pH ≤ 3時呈橙紅色，在pH 6-7時因去質子化而變為藍色，在更高pH下會降解。相反，該體系在食品典型的pH范圍（pH 3-7）內保持穩定，使其成為有前景的替代品。例如，將其加入酸奶（pH 4.4-4.6）產生橙色色調，加入牛奶則產生粉紅色調。穩定性測試顯示，除蒸餾水提取物在室溫光照下在15天前失去顏色穩定性外，大多數CASEs在光照和黑暗條件下均能保持顏色穩定性15天。其中，CASE/Gly:NaOAc (3:1) NADES在不同儲存條件下表現出最佳的長期穩定性。穩定性分析表明，溶劑類型是影響A/A0值的主要因素，儲存溫度也有顯著但較弱的影響，而光照條件無顯著差異。A/A0比值大于1可能表明在相同或相近波長處有降解產物形成，導致吸光度短暫變化。
3.4總多酚含量（TPC）測定
在本研究中，當使用Gly:NaOAc (3:1) NADES作為提取溶劑時，Hass品種CASE樣品中的多酚含量最高，其次是Fuerte品種，其值分別為203.45和171.92 mg GAE/100g鮮重，顯著高于使用其他溶劑評估所得的值。類似趨勢此前已有報道，使用膽堿氯:乳酸（2:1）低共熔溶劑從牛油果皮中提取得到了高多酚含量。因此，溶劑選擇是控制酚類化合物提取效率的關鍵因素，低共熔組成、pH和粘度等參數強烈影響提取性能。
3.5抗氧化活性
本研究中，CASE/Gly:NaOAc (3:1) 體系樣品的最高抗氧化活性，通過TAC測定，Fuerte提取物為3980.33 μmol Cu2+還原當量每毫升，Hass品種為1980.33 μmol Cu2+還原當量每毫升。牛油果品種和提取溶劑均顯著影響抗氧化能力。Fuerte品種的抗氧化活性高于Hass品種。同樣，使用NADES獲得的提取物其抗氧化能力顯著高于乙醇和蒸餾水提取物，而后兩者間無顯著差異。480 nm處吸光度與抗氧化能力之間的關系并非嚴格線性，且受溶劑和牛油果品種的顯著影響。在水提物中，相對較高的吸光度值與較低的抗氧化活性相關，表明顏色強度本身并不能可靠反映生物活性。相比之下，使用Gly:NaOAc (3:1) NADES獲得的提取物對兩個品種都表現出最高的抗氧化能力，即使其吸光度值與乙醇提取物相當或更低。這些發現表明，低共熔溶劑提高了多酚提取效率，并有助于保持抗氧化功能。
3.6細胞毒性
甘油和乙酸鈉在低濃度使用時通常被認為無毒，但仍需評估本研究合成的Gly:NaOAc (3:1) NADES及其摻入食品基質后的潛在毒性以確保產品安全。對于Fuerte品種的CASE樣品，在測試濃度范圍（0.0005 至 5 mg mL-1）內，暴露24小時和48小時后，與對照相比，各濃度間細胞活力均未觀察到顯著差異。對于Hass品種的CASE樣品，水提物在暴露24小時和48小時后均未表現出細胞毒性作用，而醇提物僅在24小時內無細胞毒性。暴露48小時后，濃度高于0.5 mg mL-1的醇提物誘導了細胞毒性，導致細胞活力適度降低。這種在48小時觀察到的細胞毒性
