《Journal of Food Composition and Analysis》：New HPLC method for the separation and quantitation of individual milk proteins in human breast milk and bovine milk
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本研究針對現有方法在分析熱處理人乳時易失真的難題，開發了一種快速、可靠的RP-HPLC/UV方法。該方法成功實現了人乳中β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶和人血清白蛋白等6種關鍵蛋白的同步分離與準確定量，并能同時用于分離牛乳蛋白及其常見遺傳變體。研究明確揭示了新HPLC方法相較于凱氏定氮法的優越性，為精確評估乳品營養與安全提供了強有力的分析工具。
母乳，被譽為嬰兒最理想的“液體黃金”，其復雜的成分對嬰兒的健康成長和長期發育具有深遠影響。其中，蛋白質不僅是構建生命的基礎營養素，許多乳蛋白還承擔著免疫保護、抗菌、促進礦物質吸收等重要生物學功能。然而，人乳的蛋白質組成并非一成不變，它受到母親飲食、健康狀況、哺乳階段等多種因素的影響。準確解析人乳中各類蛋白質的具體含量，對于評估其營養價值、指導特殊嬰兒（如早產兒）喂養、優化嬰兒配方奶粉設計至關重要。
傳統的乳蛋白分析方法，如凱氏定氮法，雖然能測定總氮或總蛋白含量，但無法區分具體的蛋白質種類。更關鍵的是，在分析經過巴氏殺菌處理（這是母乳庫的標準操作，旨在殺滅病原體）的人乳樣品時，熱處理會導致乳清蛋白變性并與酪蛋白膠束結合。這使得凱氏定氮法會錯誤地高估酪蛋白含量，同時低估乳清蛋白含量，從而扭曲了乳清蛋白與酪蛋白的真實比例，而這一比例是評估乳品營養特性的核心指標之一。盡管高效液相色譜（HPLC）等技術在分析牛乳蛋白方面已較為成熟，但能夠同時、快速、準確地分離和定量多種關鍵人乳單個蛋白的標準化方法仍十分缺乏。為此，Sabrina P. Van den Oever和Helmut K. Mayer開展研究，旨在建立一種可同時適用于人乳和牛乳蛋白分析的新型高效分析方法。相關研究成果發表于《Journal of Food Composition and Analysis》。
為開展本研究，研究人員主要應用了以下幾項關鍵技術方法：首先，研究收集了52份來自西班牙瓦倫西亞母乳庫的人乳捐贈樣品（其中26份為原料乳，26份經Holder法巴氏殺菌），并使用牛乳樣品進行方法開發。其次，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）聯用紫外檢測法作為核心分析手段，對樣品中的目標蛋白進行分離與定量。第三，平行使用凱氏定氮法（依據ISO/IDF標準）測定樣品中的總氮、非酪蛋白氮和非蛋白氮，以計算粗蛋白、真蛋白、酪蛋白和乳清蛋白含量，用于方法比對。第四，應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對選定的人乳樣品進行蛋白質譜分析，并與牛、羊、山羊、馬等其他物種的乳樣進行指紋圖譜對比。
3.1. 已建立的RP-HPLC-UV方法的性能
研究人員對所開發的RP-HPLC-UV方法進行了全面驗證。結果表明，該方法在線性、儀器精密度、重復性精密度、中間精密度以及準確度方面均表現優異。所有6種目標分析物（β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、人血清白蛋白、溶菌酶）的校準曲線線性決定系數（R2）均大于0.99。方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）較低，與同類研究相比具有優勢或相當。通過加標回收實驗驗證的準確度在95%至102%之間，證實了方法的可靠性。
3.2. 人乳樣品的總蛋白含量及蛋白質組分
通過凱氏定氮法分析發現，52份人乳樣品的平均粗蛋白含量約為1.2克/100克，真蛋白含量約為0.9克/100克。值得注意的是，人乳中的非蛋白氮（NPN）比例較高，平均約占粗蛋白的25%。對于原料乳，凱氏定氮法測得的平均酪蛋白和乳清蛋白含量分別為0.42克/100克和0.48克/100克。然而，在巴氏殺菌乳中，測得的酪蛋白含量異常升高（0.64克/100克），而乳清蛋白含量顯著降低（0.25克/100克），這被懷疑是由于熱處理導致乳清蛋白變性并與酪蛋白結合，干擾了凱氏法的分離測定。
3.3. 人乳蛋白的RP-HPLC分析
RP-HPLC分析成功分離并定量了人乳中的6種主要蛋白質。結果顯示，β-酪蛋白是含量最豐富的酪蛋白，在原料乳和巴氏殺菌乳中的平均濃度分別為2204毫克/升和1960毫克/升；κ-酪蛋白含量很低。在乳清蛋白中，α-乳白蛋白含量最高，其次為乳鐵蛋白。人血清白蛋白和溶菌酶也被定量。研究通過對比凱氏定氮法和HPLC法測得的乳清蛋白相對比例，清晰地揭示了兩種方法在分析熱處理乳樣時的關鍵差異：HPLC分析在原料乳和巴氏殺菌乳之間未顯示出顯著差異，因為其使用的還原性樣品緩沖液能完全溶解酪蛋白并變性乳清蛋白，從而獲得準確結果；而凱氏法則錯誤地指示巴氏殺菌乳中酪蛋白值升高、乳清蛋白值降低。HPLC色譜圖直觀展示了不同人乳樣品在單個蛋白濃度上的明顯差異。此外，該方法同樣適用于牛乳蛋白分析，能清晰分離包括αS1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白在內的主要蛋白組分及其常見遺傳變體（如κ-酪蛋白A/B型、β-酪蛋白A1/A2/B型）。
3.4. SDS-PAGE
SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析提供了人乳與其他物種（牛、綿羊、山羊、馬）乳蛋白的指紋圖譜對比。結果顯示，反芻動物乳以酪蛋白（主要是αs-酪蛋白和β-酪蛋白）為主，并含有牛乳中含量豐富的β-乳球蛋白；而人乳中β-乳球蛋白完全缺失，主要酪蛋白是β-酪蛋白，且乳清蛋白與酪蛋白的比例不固定，在哺乳不同階段變化很大。電泳圖譜也直觀顯示了不同捐贈者人乳樣品中單個乳清蛋白（如α-乳白蛋白、乳鐵蛋白）含量的巨大差異。
本研究成功開發并驗證了一種快速、可靠的反相高效液相色譜-紫外檢測法，用于同時分離和定量人乳中的六種關鍵單個蛋白質：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶和人血清白蛋白。該方法首次實現了使用同一套色譜系統對人和牛乳的單個蛋白質（包括牛乳蛋白的常見遺傳變體）進行有效分離。
研究的核心結論在于明確揭示了新型HPLC方法相對于傳統凱氏定氮法的顯著方法學優勢。特別是在分析經過巴氏殺菌的熱處理乳樣時，凱氏法因乳清蛋白變性結合而嚴重扭曲了酪蛋白與乳清蛋白的真實比例，而本研究建立的HPLC方法得益于其還原性樣品前處理緩沖液（含鹽酸胍和二硫蘇糖醇），能完全溶解酪蛋白膠束并變性乳清蛋白，從而克服了這一缺陷，獲得了準確、不受熱處理干擾的定量結果。這為解決長期困擾乳品分析，特別是母乳庫質量控制和研究領域中熱處理樣品蛋白組分準確定量的難題，提供了強有力的技術方案。
此外，研究通過SDS-PAGE證實了該技術可作為快速、可靠的蛋白質指紋圖譜工具，用于不同物種乳蛋白以及個體間差異的篩查。研究測得的人乳單個蛋白濃度范圍與已有文獻報道基本吻合，同時發現不同捐贈者及不同哺乳階段樣品間存在顯著差異，這凸顯了人乳蛋白質組成的動態性和個體性。
綜上所述，該研究不僅提供了一種高精度、高通量的乳蛋白分析新工具，其結論也對精確評估人乳的營養價值、指導嬰幼兒配方食品開發、優化母乳庫的質控流程以及開展相關的比較營養學研究具有重要的理論和實踐意義。
