盡管診療手段不斷進步，遠處轉移仍是導致結直腸癌（CRC）患者死亡的主要原因。近年來，腫瘤微環境（TME）和腸道微生物群在轉移中的作用日益受到關注，但起源于口腔的細菌是否以及如何通過免疫重編程影響CRC轉移，其機制尚不完全清楚。本研究聚焦于口腔共生菌唾液鏈球菌（S. salivarius），旨在揭示其通過調控中性粒細胞免疫反應促進CRC轉移的分子機制。

研究首先通過收集CRC患者及健康對照的舌苔樣本，以及治療前CRC患者的腫瘤及配對癌旁組織，進行了多部位微生物組分析。16S rRNA測序結果顯示，CRC患者的舌苔菌群與健康對照存在明顯差異，其中鏈球菌屬（Streptococcus）在CRC患者舌苔中顯著富集。進一步在物種水平分析發現，唾液鏈球菌（S. salivarius）在腫瘤組織中的豐度顯著高于配對癌旁組織。對CRC患者糞便樣本的分析也證實了鏈球菌屬的富集，且定量PCR顯示S. salivarius的mRNA水平在CRC患者中顯著升高。熒光原位雜交（FISH）結果進一步驗證，與癌旁組織相比，腫瘤組織中S. salivarius信號增強。此外，臨床相關性分析發現，S. salivarius的豐度與腫瘤負荷、淋巴結轉移等臨床指標呈正相關。這些多平臺數據一致表明，S. salivarius在CRC患者的口腔、糞便和腫瘤相關生態位中持續富集。

在功能驗證前，研究團隊在體外培養了S. salivarius并確定了其最佳感染復數（MOI=100）。隨后，利用皮下CT26腫瘤小鼠模型，研究者發現口服S. salivarius可顯著增加小鼠的腫瘤負荷。對腫瘤組織的轉錄組分析顯示，中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）形成相關通路被顯著富集。流式細胞術分析證實，S. salivarius處理組小鼠的外周血和腫瘤組織中Ly6G⁺CD11b⁺中性粒細胞顯著增多，而其他免疫細胞群如CD4⁺/CD8⁺T細胞、巨噬細胞等則無顯著變化，表明S. salivarius暴露可選擇性誘導中性粒細胞在體內積累。

為探究S. salivarius是否直接影響CRC細胞的轉移行為，研究進行了細胞功能實驗。CCK-8增殖實驗表明，S. salivarius在不同MOI下對多種CRC細胞系的增殖無顯著影響。然而，Transwell遷移實驗顯示，S. salivarius能以劑量依賴的方式顯著增強Difi和SW480細胞的遷移能力。在實驗性肺轉移模型中，通過尾靜脈注射CT26-luc細胞建立小鼠模型，并每日口服S. salivarius�；铙w生物發光成像顯示，與對照組相比，S. salivarius處理組小鼠肺部的轉移信號隨時間顯著增強，肺部轉移結節數量增多，H&E染色也證實了更廣泛的轉移性病灶。這些發現表明，S. salivarius能夠選擇性地增強CRC細胞的遷移能力，并在體內促進遠處轉移定植。

為評估S. salivarius誘導的中性粒細胞活化是否促進CRC細胞遷移，研究者建立了Transwell共培養體系。結果顯示，經S. salivarius刺激的中性粒細胞可顯著增強CRC細胞的遷移，而用DNA酶I（DNase I）降解NETs的DNA骨架可部分減弱此效應。蛋白質印跡和qRT-PCR分析證實，S. salivarius刺激可顯著上調中性粒細胞中瓜氨酸化組蛋白H3（citH3）以及髓過氧化物酶（MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、肽�；�精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）等NET相關標志物的表達，DNase I處理可抑制這些誘導。體內外免疫熒光染色也觀察到，S. salivarius處理組中，腫瘤組織內存在大量citH3⁺/Ly6G⁺的NETs結構，且與腫瘤細胞密切關聯。這些數據表明，S. salivarius能強力激活中性粒細胞形成NETs，從而促進CRC細胞的遷移和轉移表型。

轉錄組分析發現，免疫相關GTP酶M1（IRGM1）是CRC腫瘤組織中上調最顯著的基因之一。在體外，S. salivarius刺激可顯著誘導小鼠骨髓來源中性粒細胞中Irgm1的表達。免疫組化（IHC）分析也證實，CRC患者腫瘤組織中IRGM1蛋白水平高于癌旁組織。為探究Irgm1的功能，研究者構建了中性粒細胞特異性Irgm1條件性敲除（Irgm1-cKO）小鼠。在肺轉移模型中，雖然S. salivarius在野生型（WT）和Irgm1-cKO小鼠腸道內定植水平相當，但Irgm1-cKO小鼠的肺轉移負荷相較于WT小鼠顯著降低。這證明中性粒細胞中的Irgm1是S. salivarius誘導CRC轉移所必需的。

機制上，研究通過免疫沉淀-質譜（IP-MS）、分子對接和鄰近連接實驗（PLA）發現，IRGM1與含有IQ基序的GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）存在物理相互作用并形成穩定復合物。轉錄組分析表明，Irgm1缺失會導致中性粒細胞中Wnt通路相關基因協同下調。qPCR篩選發現，S. salivarius可選擇性上調Wnt家族中的Wnt5a表達。蛋白質印跡分析證實，S. salivarius刺激可增加IQGAP1和WNT5a的蛋白水平，并激活下游的PI3K/AKT信號通路。功能上，S. salivarius可增強中性粒細胞的遷移能力并提高NETs標志物水平。使用Wnt通路抑制劑XAV-939處理可抑制S. salivarius誘導的citH3表達，而激活劑LiCl則可部分挽救Irgm1缺失中性粒細胞中NETs形成的缺陷。這些結果支持了一個模型：S. salivarius通過激活中性粒細胞中的IRGM1-IQGAP1-Wnt5a-PI3K/AKT信號軸來促進NETs形成。

單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析顯示，S. salivarius處理顯著改變了腫瘤免疫微環境的細胞異質性，并上調了包括Cxcl2、S100a8、Irgm1在內的炎癥和信號相關基因。對不同小鼠腫瘤模型（皮下瘤、肺轉移瘤、原位CRC瘤）的免疫熒光分析發現，S. salivarius處理均能增加腫瘤組織中CD11b⁺髓系細胞的浸潤，并增強Wnt5a、Iqgap1和Irgm1的熒光信號強度，表明IRGM1-IQGAP1-WNT5信號軸在體內被激活。此外，在腫瘤組織和S. salivarius處理的小鼠中，上皮-間質轉化（EMT）相關標志物和NETs蛋白的表達也發生了相應改變。這些數據表明，S. salivarius通過激活中性粒細胞的IRGM1-IQGAP1-WNT5信號軸，重塑了CRC腫瘤微環境，并與促轉移表型相關。

本研究從臨床觀察出發，揭示了口腔共生菌S. salivarius在CRC患者多個部位富集，并與腫瘤進展和轉移相關。研究闡明了一條由S. salivarius觸發、經IRGM1-IQGAP1復合物介導、激活Wnt5a-PI3K/AKT信號、最終導致NETs形成和CRC轉移的完整分子通路。這不僅為理解“口-腸軸”在癌癥轉移中的作用提供了新的機制見解，也提示靶向IRGM1-Wnt-NETs信號軸或可成為抑制CRC轉移的新策略。此外，S. salivarius作為潛在的非侵入性生物標志物，或有助于識別具有高轉移風險的CRC患者，為邁向微生物組導向的精準腫瘤學提供了新方向。