《Advanced Science》：Sirt3 Genetically Engineered Apoptotic Bodies Alleviate Skeletal Aging by Limiting Aggravated NLRP3 Inflammasome Activation of Senescent Macrophages
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這篇研究性論文揭示了衰老進程中巨噬細胞功能障礙（免疫衰老）加劇骨骼老化的新機制。研究發現，巨噬細胞衰老導致線粒體去乙酰化酶Sirt3表達下降，進而通過抑制NLRP3蛋白的泛素化降解，導致NLRP3炎癥小體異常激活并分泌過量IL-1β，最終加速老年性骨質疏松。研究團隊創新性地構建了基于凋亡小體（Apoptotic Bodies, ABs）的靶向遞送平臺，證實Sirt3富集的凋亡小體（ABs-Sirt3）可有效抑制炎癥小體活化，延緩骨骼衰老，為治療年齡相關性骨質疏松提供了基于納米技術的新型治療策略。
骨骼衰老與免疫衰老的關聯
骨骼衰老以脆性增加、骨量減少和骨微結構惡化為特征。年齡相關性骨質疏松在全球老齡化背景下日益普遍，帶來沉重的社會經濟負擔。盡管已知衰老相關的巨噬細胞免疫功能障礙（即免疫衰老）參與此過程，但其具體機制尚不明確。全身性低度炎癥（即“炎性衰老”）被認為是加速年齡相關疾病的關鍵因素，而NLRP3（Nod樣受體家族蛋白3）炎癥小體的異常激活是驅動這種慢性炎癥的重要原因。NLRP3炎癥小體主要由傳感器蛋白NLRP3、效應蛋白caspase-1和銜接蛋白ASC組成，激活后會導致caspase-1自剪切成熟，進而切割IL-1β和IL-18的前體，釋放促炎細胞因子，參與包括骨代謝在內的多種生理病理過程。
衰老加劇巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活并誘導骨質疏松
為證實衰老巨噬細胞的免疫功能障礙是否參與骨骼衰老，研究構建了在髓系細胞中特異性敲除Nlrp3基因的條件性敲除小鼠模型（Nlrp3fl/flLysM-Cre）。研究發現，在年輕小鼠（4月齡）中，Nlrp3敲除與野生型小鼠骨量無顯著差異；而在老年小鼠（24月齡）中，Nlrp3敲除顯著延緩了骨丟失，表現為更高的骨小梁厚度、骨體積分數和骨小梁數量。組織學分析進一步證實，Nlrp3敲除老年小鼠的骨形成增加，而破骨細胞數量和骨吸收標志物CTX-I水平降低，骨髓脂肪積累減少。這些結果證實，抑制NLRP3炎癥小體可延緩骨骼衰老。
機制上，研究團隊用不同的NLRP3激動劑（如尼日利亞菌素、二氧化硅、咪喹莫特）刺激從年輕和老年小鼠分離的骨髓源性巨噬細胞。結果顯示，老年巨噬細胞在刺激后產生了更多的成熟caspase-1（P20）和IL-1β（P17），細胞因子釋放量近乎翻倍，ASC斑點形成和寡聚化也更為顯著。類似現象在人外周血單個核細胞中同樣得到證實。這些結果表明衰老伴隨著巨噬細胞對NLRP3炎癥小體激活的敏感性增加。
為進一步明確NLRP3缺失影響骨代謝的途徑，研究排除了其直接調控成骨細胞或破骨細胞分化的可能性。體外誘導實驗表明，髓系細胞特異性敲除Nlrp3并不影響破骨細胞或成骨細胞的分化能力。然而，NLRP3炎癥小體激活的主要產物IL-1β（而非IL-18）能夠顯著促進破骨細胞生成，并抑制成骨細胞分化。在脂多糖誘導的炎癥模型中，Nlrp3條件性敲除小鼠也表現出破骨細胞分化和功能受損，同時骨形成率和骨鈣素水平升高。因此，研究結論是衰老巨噬細胞對NLRP3炎癥小體的過度激活導致IL-1β等細胞因子分泌增加，進而間接破壞骨穩態，加速骨骼衰老。
衰老導致Sirt3缺陷并增強炎癥信號通路活性
為探究衰老巨噬細胞免疫功能失調的上游機制，研究重新分析了已發表的年輕與老年小鼠骨髓CD11b+巨噬細胞的轉錄組數據。分析發現，衰老巨噬細胞中炎癥反應相關基因顯著上調。在眾多與長壽和炎癥調控相關的基因家族中，研究聚焦于Sirtuins家族。該家族是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的脫乙酰酶，被認為是延緩衰老的關鍵調節因子。轉錄組數據和實驗驗證均顯示，在衰老巨噬細胞中，僅有Sirt2和Sirt3的表達下降，而其他成員如Sirt1、Sirt4-7等無明顯變化。然而，在蛋白水平上，僅Sirt3在老年巨噬細胞中顯著降低。使用Sirt3抑制劑3-TYP或構建髓系細胞特異性Sirt3敲除小鼠（Sirt3fl/flLysM-Cre），均能加劇NLRP3炎癥小體的激活。劑量實驗進一步表明，Sirt3的缺失是介導NLRP3炎癥小體過度激活的主要因素。
Sirt3缺陷加劇NLRP3炎癥小體激活并加速骨骼衰老
髓系細胞特異性敲除Sirt3的小鼠表現出加速的骨丟失，骨小梁體積、數量、厚度降低，分離度增加。組織學分析顯示，這些小鼠骨髓脂肪增多，破骨細胞數量增加，血清CTX水平升高，而成骨細胞數量、新骨形成和骨形成率降低。從這些小鼠分離的巨噬細胞，在多種NLRP3激動劑（而非NLRC4或AIM2炎癥小體激動劑）刺激下，表現出更強烈的caspase-1和IL-1β切割、ASC斑點形成及寡聚化，表型與衰老巨噬細胞一致。
盡管Sirt3缺失本身會直接損害破骨細胞的分化，但其在巨噬細胞中間接導致的IL-1β分泌大幅增加，對破骨細胞的促進作用遠超過其直接抑制作用。體內使用IL-1β中和抗體可顯著緩解Sirt3條件性敲除小鼠的骨丟失，證實了IL-1β的核心作用。這些發現共同表明，衰老過程中Sirt3的缺失介導了巨噬細胞NLRP3炎癥小體的高敏感性，從而導致年齡相關性骨質疏松。
Nlrp3敲除消除Sirt3缺陷對骨代謝的負面影響
為在體內證實Sirt3缺陷通過加劇NLRP3炎癥小體激活導致骨質疏松，研究構建了Nlrp3和Sirt3雙敲除小鼠（Nlrp3KOSirt3CKO）。與僅敲除Sirt3的小鼠不同，雙敲除小鼠保持了健康的骨量，其骨表型與僅敲除Nlrp3的小鼠相似，甚至優于野生型小鼠。雙敲除小鼠的破骨細胞數量、血清CTX水平顯著降低，而成骨細胞活性、新骨形成率和骨鈣素水平顯著升高。在脂多糖誘導的敗血癥模型中，Sirt3缺失導致的IL-1β和IL-18分泌增加，在雙敲除小鼠中被完全阻斷。這些結果強有力地證明，Sirt3缺失的負面骨效應完全依賴于NLRP3炎癥小體的激活。
Sirt3促進NLRP3降解并破壞炎癥小體組裝
機制深入研究表明，Sirt3缺失或衰老并不影響Nlrp3的mRNA水平，但顯著提高了NLRP3的蛋白基礎水平和LPS誘導后的表達水平。蛋白質降解動力學實驗發現，Sirt3充足或年輕的巨噬細胞中NLRP3蛋白降解更快。當使用蛋白酶體抑制劑MG132或溶酶體抑制劑氯化銨阻斷降解途徑時，不同組間的NLRP3蛋白水平趨于一致，表明Sirt3通過促進NLRP3降解來調控其蛋白穩定性。
進一步研究顯示，衰老和Sirt3缺陷會大幅降低NLRP3的泛素化水平，同時提高其乙酰化水平。Sirt3抑制劑3-TYP也能產生類似效果。在HEK293T細胞中過表達Sirt3，可劑量依賴性地增強NLRP3泛素化并降低其乙酰化，而失去脫乙酰酶活性的Sirt3突變體（H248Y）則無此作用。已知NLRP3的K21、K22、K24位點是其乙酰化修飾位點。研究構建了模擬持續脫乙酰化（K21/22/24R）和模擬持續乙酰化（K21/22/24Q）的NLRP3突變體。結果顯示，K21/22/24R突變體促進了NLRP3的泛素化和降解，并幾乎完全阻斷了IL-1β的分泌；而K21/22/24Q突變體則抵抗泛素化降解，功能與野生型相似。綜上所述，Sirt3通過脫去NLRP3蛋白K21/22/24位點的乙酰基，促進其泛素化修飾，進而通過蛋白酶體或溶酶體途徑加速降解，從而限制炎癥小體的過度組裝與激活。
構建用于遞送Sirt3的工程化凋亡小體
鑒于Sirt3缺乏特異性激動劑，且基因治療面臨挑戰，研究團隊轉向開發生物遞送平臺。細胞外囊泡，尤其是凋亡小體，因其表面富含可被巨噬細胞特異性識別的磷脂酰絲氨酸（“吃掉我”信號），成為靶向巨噬細胞的理想載體。研究通過慢病毒感染使骨髓間充質干細胞過表達Sirt3，隨后用星形孢菌素誘導其凋亡，分離純化出Sirt3富集的凋亡小體。透射電鏡顯示其為圓形囊泡，直徑在105-1106納米之間。該ABs-Sirt3能高效被巨噬細胞吞噬，并成功將Sirt3遞送至細胞內。
體外實驗證實，用ABs-Sirt3預處理巨噬細胞，可促進NLRP3的泛素化和脫乙酰化，并有效抑制LPS+ATP刺激后的caspase-1和IL-1β切割。在治療應用中，老年小鼠靜脈注射熒光標記的ABs-Sirt3后，顯示其在骨骼中有良好的天然趨向性。經過8周治療，與注射對照凋亡小體或PBS的老年小鼠相比，注射ABs-Sirt3的老年小鼠骨丟失顯著延緩，表現為更高的骨小梁數量、骨體積分數，更低的骨小梁分離度。同時，治療組小鼠的破骨細胞數量和血清CTX水平降低，而成骨活性和骨形成率提高。這些結果證明，Sirt3基因工程化凋亡小體是治療年齡相關性骨質疏松的潛力候選方案。
討論與展望
本研究系統闡明了巨噬細胞衰老過程中Sirt3表達下降導致NLRP3蛋白穩定性增加、炎癥小體過度激活、進而通過IL-1β破壞骨穩態、加速骨質疏松的完整機制軸心：Sirt3下調 → NLRP3乙酰化增加/泛素化減少 → NLRP3蛋白積累 → NLRP3炎癥小體過度激活 → IL-1β分泌增加 → 破骨細胞生成增強/成骨細胞生成抑制 → 骨骼衰老。該工作不僅揭示了免疫衰老參與骨骼老化的一種新機制，還創新性地利用凋亡小體的天然靶向性，構建了遞送Sirt3的納米治療平臺，為干預年齡相關性骨質疏松及其他炎癥衰老相關疾病提供了新的思路和潛在療法。未來的研究需在雌性老年動物模型中驗證該機制，并進一步探索該靶向遞送系統的臨床轉化潛力。
