CD8⁺T細胞是抵抗癌癥的關鍵免疫細胞，但持續暴露于腫瘤抗原會導致其功能耗竭。在腫瘤微環境中，存在兩種功能狀態不同的耗竭CD8⁺T細胞亞群：終末耗竭T（Tex）細胞和祖源耗竭T（Tpex）細胞。Tex細胞高表達PD-1、TIM-3等多種抑制性受體，效應功能低下，對免疫檢查點阻斷（ICB）療法反應不佳。相反，Tpex細胞具有干細胞樣特性（通常表現為TCF1⁺TIM-3^-表型），能夠自我更新并分化為效應細胞，是介導持久抗腫瘤免疫反應、并對ICB和過繼性細胞治療（ACT）產生應答的關鍵細胞群。細胞代謝，特別是線粒體氧化磷酸化（OXPHOS），在維持Tpex細胞的干性和長期增殖潛能中起著核心作用。因此，探索能夠調控CD8⁺T細胞代謝、增強其干性的策略，對于改善免疫治療療效具有重要意義。二異丙胺二氯乙酸鹽（DADA）是丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）的有效抑制劑，臨床長期用作保肝藥，安全性良好。盡管已知DADA能通過抑制糖酵解抑制腫瘤細胞生長，但其對CD8⁺T細胞代謝、干性及抗腫瘤免疫功能的影響尚不明確。

研究人員首先在B16-F10黑色素瘤、MC38結腸癌皮下移植瘤以及B16-F10肺轉移瘤等多種小鼠模型中評估了DADA的體內抗腫瘤效果。他們發現，無論是從接種腫瘤前兩周開始持續給藥，還是僅在接種前進行預處理，口服DADA均能顯著抑制腫瘤的生長和轉移，并且對小鼠表現出良好的安全性。進一步的機制探索表明，DADA的抗腫瘤效果依賴于CD8⁺T細胞。在DADA處理的荷瘤小鼠體內，腫瘤浸潤CD8⁺T細胞的數量顯著增加，并且這些細胞產生效應細胞因子（如IFN-γ和TNF-α）和顆粒酶B（GZMB）的能力也更強。當通過抗體清除CD8⁺T細胞后，DADA的抑瘤作用完全消失，而清除CD4⁺T細胞或NK細胞則不影響其效果。這些結果表明，DADA是通過增強宿主CD8⁺T細胞的抗腫瘤免疫應答來發揮作用的。

為了深入理解DADA如何增強CD8⁺T細胞功能，研究人員對MC38荷瘤小鼠腫瘤中的免疫細胞進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）。分析發現，DADA處理顯著富集了腫瘤微環境中的CD8⁺T細胞，并且這些細胞的基因表達譜顯示與T細胞激活和分化相關的通路上調。通過對CD8⁺T細胞進行亞群細分，他們發現DADA處理導致終末耗竭CD8⁺T細胞比例呈下降趨勢，而增殖性CD8⁺T細胞比例上升。這一發現在蛋白層面得到了驗證。流式細胞術分析顯示，DADA處理顯著降低了腫瘤和引流淋巴結中CD8⁺T細胞中PD-1⁺TIM-3⁺和TCF1^-TIM-3⁺的Tex細胞亞群比例，同時增加了干細胞樣TCF1⁺TIM-3^-的Tpex細胞亞群比例。此外，DADA還降低了耗竭關鍵轉錄因子TOX的表達，并提高了增殖標志物Ki67的表達。這些數據共同表明，DADA能夠引導CD8⁺T細胞向更少的終末耗竭和更多的干細胞樣狀態分化。

為了確認DADA是否直接調控CD8⁺T細胞的耗竭分化，研究人員在體外用抗CD3/CD28抗體持續刺激小鼠脾臟來源的CD8⁺T細胞，模擬耗竭過程。在刺激過程中加入DADA后，他們觀察到類似的現象：Tex細胞比例下降，Tpex細胞比例以及干性相關標志物Ly108的表達上升，同時TNF-α和IFN-γ的產生增加。值得注意的是，DADA在短期（24或48小時）刺激中會抑制效應因子的產生，這說明其在慢性刺激模型中促進的細胞因子增加，是其減少終末耗竭的結果，而非直接增強早期效應功能。在抗原特異性OT-1 CD8⁺T細胞以及人外周血CD8⁺T細胞的體外實驗中，DADA同樣表現出促進干細胞樣表型（如增加CD62L⁺CCR7⁺亞群）、減少耗竭標志物的作用。進一步的RNA測序分析證實，DADA處理的CD8⁺T細胞中，與干性和效應功能相關的基因（如^Tcf7, ^Ifng）表達上調，而與終末耗竭相關的基因（如^Tox）表達下調。DADA是PDK的抑制劑。在四種PDK同工酶中，RNA-seq數據顯示^Pdk1在耗竭CD8⁺T細胞中高表達，且能被DADA下調。通過CRISPR-Cas9技術敲低^Pdk1，能夠模擬DADA的效果，即減少耗竭、增強干性和細胞因子產生；而在^Pdk1敲低的細胞中，DADA無法再產生額外增益。相反，敲低^Pdk2、^Pdk3或^Pdk4則無此效應。這些結果證明，DADA是通過靶向PDK1來增強CD8⁺T細胞干性的。

PDK1通過磷酸化抑制丙酮酸脫氫酶復合體（PDC）的活性，而PDC負責將丙酮酸不可逆地轉化為乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），這是連接糖酵解與三羧酸循環（TCA）及后續OXPHOS的關鍵步驟。抑制PDK1應能促進這一代謝流。實驗證實，DADA處理確實提高了CD8⁺T細胞內Acetyl-CoA的水平。通路富集和基因集富集分析（GSEA）均顯示，DADA處理顯著富集了OXPHOS、mTOR信號和碳代謝等通路。qPCR檢測發現OXPHOS相關基因（如^Cox5a）表達上調。Seahorse能量代謝分析進一步提供了直接證據：DADA處理顯著提高了CD8⁺T細胞的耗氧率（OCR），包括基礎呼吸、最大呼吸和備用呼吸能力，表明OXPHOS增強。值得注意的是，DADA對細胞的糖酵解（通過細胞外酸化率ECAR測量）影響甚微。線粒體是OXPHOS的場所，其功能狀態至關重要。DADA處理改善了CD8⁺T細胞的線粒體適應性，表現為線粒體膜電位和線粒體質量的增加，以及線粒體活性氧（ROS）產生的減少。這種代謝改善也在OT-1細胞和人CD8⁺T細胞中得到驗證。為了確認增強的OXPHOS是DADA促進干性的原因，研究人員使用了OXPHOS抑制劑寡霉素。當寡霉素阻斷OXPHOS后，DADA在減少耗竭、增強干性和改善線粒體功能方面的所有有益效應都被抵消。相反，直接給細胞補充Acetyl-CoA可以模擬DADA的效應，并且聯合使用Acetyl-CoA和DADA沒有疊加效果。此外，使用UK5099阻斷線粒體丙酮酸載體（MPC），從而阻止丙酮酸進入線粒體，同樣廢除了DADA的作用。這些數據共同闡明了一條清晰的機制通路：DADA通過抑制PDK1，促進丙酮酸向Acetyl-CoA轉化，從而增強OXPHOS和線粒體適應性，最終維持了CD8⁺T細胞的干細胞樣特性。

由于Tpex細胞是響應過繼性細胞治療（ACT）和ICB療法的關鍵群體，研究人員評估了DADA對這兩種主流免疫療法的增效作用。在ACT模型中，他們將經過DADA體外處理的OT-1 CD8⁺T細胞過繼轉移給MC38-OVA荷瘤小鼠。與對照組細胞相比，DADA處理過的OT-1細胞表現出更強的體內抗腫瘤活性，能更有效地控制腫瘤生長。這些細胞在受體小鼠的腫瘤微環境中數量更多，增殖（Ki67⁺）更活躍，并且保持了更高的Tpex細胞比例和更強的效應因子分泌能力，表明其體內持久性和抗腫瘤功能更優。在ICB模型中，研究人員在MC38、B16-F10等多種免疫原性不同的皮下腫瘤模型中，將DADA口服處理與抗PD-1抗體聯合使用。結果顯示，DADA能夠顯著增強抗PD-1單藥的療效，更有效地抑制腫瘤生長。這種協同增效同樣伴隨著腫瘤內CD8⁺T細胞數量的增加、Tpex細胞的富集以及效應細胞因子產生水平的提升。這表明，DADA通過擴充和維持對免疫治療有響應的Tpex細胞庫，從而增強了PD-1阻斷的治療效果。

最后，研究將視角轉向臨床應用前景廣闊的CAR-T細胞療法。研究人員在體外制備靶向CD19的第二代CAR-T細胞，并在擴增過程中加入DADA處理。結果顯示，DADA處理使CAR-T細胞中具有干細胞/中央記憶表型（CD62L⁺CCR7⁺）的群體比例增加，并促進了CAR-T細胞的體外擴增。當這些經過DADA“預處理”的CAR-T細胞經歷多輪與CD19⁺Raji腫瘤細胞的共培養刺激（以誘導耗竭）時，它們表現出更低的耗竭標志物（PD-1, LAG-3, TIM-3, CD39）表達和更高的效應分子（IFN-γ, TNF-α, GZMB）表達。在Raji淋巴瘤荷瘤的免疫缺陷小鼠模型中，輸注低于常規劑量的、經DADA處理過的CAR-T細胞，相比對照組細胞，能更有效地控制腫瘤進展，延長小鼠生存期。并且，在受體小鼠外周血中能檢測到更多數量的、且耗竭標志物表達更低的CAR-T細胞，表明其體內持久性更好。重要的是，沒有觀察到DADA處理引起額外的組織損傷。這些發現強調了DADA作為一種簡單、安全的“預處理”策略，在賦予CAR-T細胞更強干性、更好持久性和抗耗竭能力方面的巨大潛力，有望降低有效治療所需的細胞劑量，從而降低CAR-T療法的成本和制造時間。

本研究系統闡述了DADA如何通過靶向PDK1，重塑CD8⁺T細胞代謝，增強其OXPHOS和線粒體功能，從而阻止終末耗竭、維持干細胞樣特性，最終提升抗腫瘤免疫及多種免疫治療策略的療效。這一發現深化了我們對DADA抗腫瘤機制的理解：它不僅可以直接抑制腫瘤細胞糖酵解，還能“賦能”免疫系統，具有雙重作用。研究特別指出，在不擾動糖酵解的前提下，專一性地增強OXPHOS就足以維持T細胞干性，這提示線粒體功能可能是比糖酵解轉換更上游的調控樞紐。DADA對CAR-T細胞的增效作用，為降低這種昂貴療法成本、提高可及性提供了新思路。該研究揭示了代謝干預在腫瘤免疫治療中的重要作用，為將DADA這類安全性已知的“老藥”應用于改善癌癥免疫治療奠定了堅實的臨床前基礎。