《Advanced Science》：Sustainable Phosphorylated Cellulose Nanocrystals: A Dual-Affinity Platform for High-Efficiency Enrichment of Intact Glycopeptides and Phosphopeptides
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本文報道了一種通過一步磷酸水解綠色合成磷酸化纖維素納米晶體（P-CNCs）的新策略。該材料可利用表面豐富的羥基，基于親水作用色譜（HILIC）捕獲糖肽；其固有磷酸基團能直接螯合Ti4+離子（P-CNCs-Ti4+）用于磷酸肽富集，無需化學衍生。研究表明，該平臺能從微量人血清中高效鑒定N-糖基化和O-GalNAc糖肽，并在小鼠肝臟中深度分析磷酸化修飾，性能優于商業材料。其綜合生命周期評估展現了顯著的環境可持續性和成本優勢，為糖蛋白組學與磷酸化蛋白組學研究提供了高效、綠色、經濟的多功能分析平臺。
引言
蛋白質的翻譯后修飾是調控蛋白質折疊、定位、周轉與功能的關鍵細胞機制。其中，蛋白質糖基化與磷酸化是最重要的兩種修飾，深刻影響著眾多生物學過程與疾病發生。盡管質譜分析技術已大規模應用于蛋白質與多肽研究，但由于非修飾肽段的高豐度與修飾肽段的低電離效率，在質譜分析前對磷酸肽和糖肽進行有效富集仍是必要步驟。傳統的富集材料制備過程通常繁瑣、昂貴且不環保。因此，開發一種高效、綠色且可持續的新型富集平臺，對于推動糖蛋白組學與磷酸化蛋白組學的發展至關重要。
結果與討論
P-CNCs與P-CNCs-Ti4+的制備與表征
本研究通過一步磷酸水解微晶纖維素，簡易合成了磷酸化纖維素納米晶體。所得的P-CNCs材料表面富含羥基和磷酸基團。其豐富的羥基賦予材料優異的親水性，適用于基于親水作用色譜模式的糖肽捕獲；而引入的磷酸基團則可作為直接螯合位點，與Ti4+離子結合形成P-CNCs-Ti4+，用于磷酸肽的富集，無需額外的化學衍生步驟。4+ chelation yields P-CNCs-Ti4+for selective phosphopeptide enrichment via IMAC.">
透射電鏡表征顯示，P-CNCs及其Ti4+螯合產物均呈現良好分散的短棒狀形貌，平均長度約423納米，直徑約10納米，Ti4+的配位未引起結構聚集。X射線衍射分析證實了材料的水解后結晶性，P-CNCs的結晶度高于原料微晶纖維素。X射線光電子能譜證實了P-CNCs-Ti4+中C、O、P、Ti元素的存在，高分辨率譜圖顯示了P-O/P=O和Ti4+/Ti-O的特征峰。Zeta電位測量顯示，從P-CNCs的-11.56 mV到P-CNCs-Ti4+的+1.96 mV的顯著偏移，成功證實了Ti4+離子的螯合。4+. Transmission electron microscopy (TEM) images of P-CNCs (a) and P-CNCs-Ti4+(b); The size distribution histograms of P-CNCs showing length (c) and diameter (d); (e) X-ray diffraction (XRD) patterns of P-CNCs before and after Ti4+coordination; (f) Corresponding crystallinity indices; High-resolution X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectra of P-CNCs-Ti4+showing the P 2p (g) and Ti 2p (h) regions; (i) Zeta potential measurements of P-CNCs (left) and P-CNCs-Ti4+(right).">
P-CNCs與P-CNCs-Ti4+對完整糖肽與磷酸肽選擇性富集性能評估
研究人員首先評估了P-CNCs對完整糖肽的富集能力。以人免疫球蛋白G的胰蛋白酶消化物為模型，通過系統優化，確定了最佳富集條件�；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析表明，富集前非糖肽信號占主導，而經P-CNCs富集后，完整糖肽的峰清晰可見，幾乎無非糖肽信號干擾。
相應地，研究人員評估了P-CNCs-Ti4+對磷酸肽的富集條件。以β-酪蛋白的胰蛋白酶消化物為模型，MALDI-TOF MS分析顯示，直接分析僅能檢測到一條單磷酸化肽段，而經P-CNCs-Ti4+富集后，所有三條磷酸肽（包括兩條多磷酸化肽段）均被清晰檢出。這些結果表明P-CNCs和P-CNCs-Ti4+能分別有效富集完整糖肽和磷酸肽。4+. (a) Direct analysis of IgG tryptic digest and (b) analysis after enrichment with P-CNCs; (c) direct analysis of β-casein tryptic digest and (d) analysis after enrichment with P-CNCs-Ti4+; (*, N-linked intact glycopeptide; ●, phosphopeptides; #, de-phosphopeptides).">
基于P-CNCs的人血清N-連接糖蛋白組深度分析
基于其高特異性，P-CNCs被進一步應用于人血清中完整N-連接糖肽的富集與鑒定。結果顯示，僅使用1微升血清胰蛋白酶消化物，在三次技術重復中，P-CNCs材料共計鑒定到2025條獨特的N-連接糖肽，對應于126個蛋白質上的264個N-糖基化位點，重現性良好。與基于麥芽糖的富集方法相比，P-CNCs使鑒定到的糖肽數量增加了40%以上，并具有互補性。P-CNCs富集的糖肽顯示出更低的等電點趨勢，這歸因于P-CNCs兼具的親水性和弱負表面電荷。對鑒定結果的分析揭示了蛋白質N-糖基化的異質性：約50%的糖蛋白僅有一個糖基化位點，而約50%的單個糖基化位點被超過五種不同的聚糖形式修飾。此外，約90%的鑒定糖肽為復合/雜合型聚糖，少于5%為高甘露糖結構。有趣的是，研究還發現了179條帶有未知聚糖修飾（大部分質量偏移為+231.09 Da）的完整糖肽，該修飾主要附著在高甘露糖型聚糖上。
為闡明P-CNCs富集N-糖肽的分子機制，研究進行了全原子分子動力學模擬。模擬顯示P-CNCs與N-糖肽之間存在有利的相互作用。軌跡分析表明糖肽與P-CNCs的相互作用在大約60納秒內接近穩定狀態。能量分解進一步揭示庫侖相互作用主導了吸引力，其主要來源于材料表面磷酸基團和羥基產生的協同氫鍵網絡和靜電場。相比之下，范德華相互作用源于最佳的空間匹配。進一步比較三種代表性N-聚糖類型（包括寡甘露糖型、復合型和雜合型）的結合親和力，模擬顯示寡甘露糖型糖肽的相互作用更強，這與實驗中復合/雜合型聚糖占主導而寡甘露糖型占比低的情況看似存在差異，推測可能源于實際血清樣本中寡甘露糖型聚糖的低豐度。
基于P-CNCs的O-糖蛋白組深度分析揭示位點特異性巖藻糖基化模式
O-GalNAc糖基化是另一種重要的蛋白質糖基化類型。利用P-CNCs材料成功富集N-糖肽的經驗，研究人員進一步將其用于富集通常糖鏈更短、親水性更弱的O-GalNAc糖肽。為避免N-糖基化干擾，人血清樣品在用胰蛋白酶消化前先用PNGase F處理以去除N-聚糖。
結果顯示，僅使用1微升血清消化物，在三次技術重復中，共計鑒定到2183條O-GalNAc糖肽。聚糖組成分析顯示，O-聚糖主要由(Hex)1(HexNAc)1(Neu5Ac)1, (Hex)1(HexNAc)1, 和(Hex)2(HexNAc)2(Neu5Ac)2組成，占總糖肽群的約50%。與N-糖基化中核心巖藻糖基化被廣泛研究不同，O-GalNAc聚糖在完整糖肽水平上的位點特異性巖藻糖基化仍鮮有表征。本研究鑒定到128條巖藻糖基化糖肽，對應于40個蛋白質的117條獨特肽序列，巖藻糖基化占有率可變。在介導抗原清除的免疫球蛋白重鏈恒定區α1上觀察到了相對較高的巖藻糖基化占有率。巖藻糖基化也在載脂蛋白C-III上被檢測到，該蛋白的Thr94是一個已知的O-GalNAc位點，在此位點鑒定到六種不同的聚糖組成，其中三種是巖藻糖基化的。在IGHA1和ApoC-III等特定蛋白質上觀察到的優先巖藻糖基化，提示了O-GalNAc巖藻糖基化的潛在功能相關性。
