輔助生殖技術（ART）顯著提高了生育率，但許多夫婦即使在經歷多個治療周期后仍難以受孕。反復種植失敗（RIF）是一個主要的臨床挑戰，其常見定義為在40歲以下女性中，至少經歷了3個新鮮或冷凍周期，移植了至少4個優質胚胎后仍未獲得臨床妊娠。約三分之二的種植失敗可歸因于子宮內膜因素。然而，不明原因RIF（uRIF）是一個特別具有挑戰性的亞組，其缺乏明確的病理特征，治療難度更大。妊娠涉及復雜的過程，其中胚胎植入是初始階段。最佳的子宮內膜容受性（ER）是成功植入的關鍵，而在月經周期的分泌中期，子宮內膜達到適合胚胎植入的最佳狀態，稱為“種植窗”（WOI）。此時，子宮內膜免疫系統轉變為免疫耐受狀態，以接受半同種異體的胚胎。因此，子宮內膜內的免疫激活會阻礙胚胎植入。代謝調節在子宮容受性中起著重要作用，但早期妊娠期間的代謝機制及其與免疫反應的相互作用尚不完全清楚。在本研究中，我們利用單細胞RNA測序和小鼠模型來研究uRIF的子宮內膜機制。我們的研究結果表明，uRIF患者的子宮內膜存在免疫平衡缺陷，特別是細胞毒性CD8⁺T細胞的異常增殖和活化，同時腺上皮糖酵解異常和乳酸生成不足，共同導致了胚胎植入失敗。

我們建立了一個uRIF患者隊列，并收集了種植窗期的子宮內膜活檢樣本進行單細胞RNA測序（scRNA-seq）。在質量控制后，共分析了來自11名uRIF患者和10名對照者的179，857個細胞。分析確定了七種主要的細胞類型：成纖維細胞、上皮細胞、巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞和纖毛上皮細胞。值得注意的是，uRIF患者子宮內膜中淋巴細胞的比例增加了近50%，而纖毛上皮細胞的比例減少了約60%。細胞通訊分析顯示，在uRIF患者中，與免疫反應相關的信號通路（如IFN-II、IL16、COMPLEMENT）占主導地位，而與子宮內膜容受性相關的通路（如EGF、TWEAK、CSF）在對照組中更突出。

+ T細胞和dNK1細胞在淋巴細胞中的比例對比。">

進一步對淋巴細胞進行分群，鑒定出十個亞群，包括CD8⁺T細胞、CD4⁺T細胞、調節性T細胞、三種NK細胞等。其中，CD8⁺T細胞是最大的亞群，并且在uRIF患者淋巴細胞中的比例顯著高于對照組。與經典的細胞毒性功能一致，子宮內膜CD8⁺T細胞高表達效應基因，如NKG7、GNLY、GZMA和GZMK。基因集富集分析顯示，與對照組相比，uRIF患者的CD8⁺T細胞中細胞毒性相關基因表達更高。通過RT-qPCR和免疫組化驗證，uRIF患者子宮內膜中CD8A和IFNG的mRNA表達以及CD8⁺T細胞的數量均顯著增加。此外，利用外部數據集分析發現，在正常月經周期中，淋巴細胞和CD8⁺T細胞的比例從增殖期到分泌期逐漸下降，并在中分泌期（即種植窗）達到最低點，提示CD8⁺T細胞比例的生理性下降對建立免疫耐受和成功植入至關重要。

差異表達基因分析顯示，在七種細胞類型中，非纖毛上皮（即腺上皮和腔上皮）具有最多的差異表達基因。通過子宮內膜容受性陣列（ERA）基因集評分發現，腺上皮在種植窗期的容受性評分最高。進一步將上皮細胞分為三個亞群：腺1上皮、腺2上皮和腔上皮。基因本體分析表明，腺1上皮富集在“生殖結構發育”、“胚胎植入”和“腺體發育”等相關功能，提示其在胚胎植入中的關鍵作用。重要的是，uRIF患者腺1上皮的ERA評分低于對照組。

對腺1上皮進行偽時序細胞軌跡分析，發現uRIF患者的細胞更多集中在軌跡早期，而對照組細胞更多分布在軌跡晚期，表明uRIF患者腺1上皮的發育存在延遲。差異表達模塊分析顯示，uRIF患者的模塊以氧化磷酸化和ATP代謝為特征，而對照組的模塊則以葡萄糖穩態和葡萄糖代謝為特征，提示uRIF患者腺上皮存在能量代謝異常。

代謝活性分析顯示，在子宮內膜所有細胞類型中，非纖毛上皮的代謝活性最高，其中腺1上皮的代謝活性尤為突出，且uRIF患者的平均代謝評分高于對照組。基因集富集分析和GSVA分析均表明，uRIF患者的腺1上皮在“氧化磷酸化”、“脂肪酸代謝”和“糖酵解”等能量相關通路上富集程度更高。然而，在糖代謝相關基因的表達上，uRIF患者腺1上皮的葡萄糖轉運關鍵基因SLC2A1（GLUT1）以及糖酵解和乳酸生成關鍵基因ALDOA、LDHA和乳酸轉運基因SLC16A3的表達水平均低于對照組。相反，促進乳酸攝取的SLC16A1和促進丙酮酸氧化的LDHB在uRIF組表達更高。這表明在對照組中，糖酵解產生的丙酮酸更多地被轉化為乳酸，而在uRIF患者中，丙酮酸更多地進入了氧化磷酸化途徑。

通過免疫組化驗證，ALDOA和LDHA蛋白主要定位在腺上皮，且在對照組中表達更高。RT-qPCR結果也一致。利用外部數據集和子宮內膜類器官數據分析發現，在正常月經周期中，SLC2A1、ALDOA、LDHA和SLC16A3在腺上皮中的表達在分泌期上調，并在種植窗期達到峰值，且孕激素刺激可顯著上調腺上皮中糖酵解和乳酸生成相關基因的表達。體外細胞實驗證實，敲低ALDOA會降低子宮內膜上皮細胞系ECC-1的糖酵解速率和糖酵解能力，而過表達ALDOA則產生相反效果。

為了探究乳酸在子宮微環境中是否對植入有益，我們在小鼠模型中進行了一側子宮角注射乳酸脫氫酶抑制劑oxamate、另一側注射PBS的對照實驗。結果顯示，oxamate注射側的胚胎植入位點數量顯著少于對照側。值得注意的是，通過同時補充外源性乳酸，可以逆轉oxamate引起的植入缺陷，表明足夠的乳酸生成對于胚胎植入至關重要。

鑒于乳酸在免疫調節中的關鍵作用，我們假設乳酸對胚胎植入的影響可能是通過影響免疫平衡實現的。細胞通訊分析顯示，腺上皮與淋巴細胞，特別是與增殖性T細胞和CD8⁺T細胞之間的信號交流最為常見，且這種相互作用的強度在uRIF患者中弱于對照組。其中，由腺上皮向淋巴細胞發出的、與免疫調節相關的信號通路（如MIF、COMPLEMENT）在集群分析中成簇，且這些通路已知受缺氧調節并與糖酵解相關。

體外實驗進一步驗證了乳酸對CD8⁺T細胞的影響。用ALDOA敲低的ECC-1細胞上清處理初始T細胞，會導致CD8⁺T細胞和IFNG⁺CD8⁺T細胞的比例升高；而過表達ALDOA的細胞上清則產生相反效果。直接使用外源性乳酸鈉處理，可顯著抑制CD8⁺T細胞的比例和IFNG的分泌。同樣，在oxamate注射的小鼠子宮內膜中，也檢測到更多的CD8⁺T細胞。為了進一步探索IFNG對植入的影響，子宮內注射重組IFNG會顯著減少該側的胚胎植入數量。對已發表胚胎數據集的分析發現，干擾素-γ受體（IFNGR）基因在胚胎各個發育階段均有表達。這些結果表明，腺上皮乳酸生成不足可能通過破壞CD8⁺T細胞的免疫平衡，并可能通過其分泌的IFNG影響胚胎，從而導致植入失敗。

為了驗證CD8⁺T細胞是否介導了乳酸對植入的影響，我們在小鼠交配前一周使用抗CD8抗體清除CD8⁺T細胞，然后進行子宮角oxamate/PBS注射實驗。在CD8⁺T細胞被有效清除后，oxamate處理側與對照側的胚胎植入數量無差異。然而，在使用抗NK抗體清除NK細胞后，oxamate處理側的植入數量仍低于對照側。這表明CD8⁺T細胞介導了乳酸對胚胎植入的影響。

為了闡明乳酸調節CD8⁺T細胞增殖和活化的機制，我們對乳酸鈉處理不同時間點的T細胞進行了批量RNA測序。差異表達分析發現，乳酸處理組的CD8⁺T細胞在24和48小時均高表達DUSP1、RGCC、JUN和FOS等基因。其中DUSP1和RGCC分別與細胞凋亡和細胞周期調控相關，其上調解釋了乳酸處理下CD8⁺T細胞增殖減少的原因。此外，乳酸處理組的差異表達基因在“抗原結合”和“DNA包裝復合體”通路富集，而在“核糖體生物合成”相關通路富集減少。轉錄因子活性分析顯示，乳酸處理組中調控IFNG表達的轉錄因子（如STAT2、IRF9）活性較低。總之，乳酸可以抑制CD8⁺T細胞的增殖和IFNG的分泌，從而有利于建立免疫平衡，促進胚胎植入。

+ T細胞比例的流式分析。(g) 在有無外源性乳酸條件下培養T細胞后，CD8⁺T細胞及IFNG⁺細胞比例的流式分析。">

本研究通過種植窗期子宮內膜的單細胞RNA測序圖譜，結合外部數據及體內外實驗，闡述了uRIF的潛在發病機制。研究發現，uRIF患者子宮內膜中具有更高比例的CD8⁺T細胞，并且高表達IFNG。同時，患者子宮內膜的一個腺上皮亞群表現出糖酵解異常和乳酸生成減少。這種乳酸代謝的缺陷破壞了CD8⁺T細胞的免疫平衡，最終導致植入失敗。

一個容受的子宮內膜環境需要對植入的胚胎具有足夠的免疫耐受性。在種植窗期，母體子宮內膜轉變為免疫耐受狀態以保護胚胎。我們的研究揭示了uRIF患者與對照組在種植窗期子宮內膜免疫微環境的顯著差異。淋巴細胞，特別是細胞毒性CD8⁺T細胞比例的增加，提示免疫平衡建立的失敗和子宮內膜容受性不良。CD8⁺T細胞可能通過分泌IFNG等細胞因子，或干擾蛻膜化和血管重塑等間接機制導致植入失敗。

同時，我們觀察到uRIF患者子宮內膜腺上皮存在糖酵解異常和乳酸生成不足。腺體的正常發育對于妊娠建立至關重要。在子宮內膜所有細胞類型中，腺上皮的代謝最為活躍。與對照組相比，uRIF患者的腺上皮表現出異常的糖酵解和乳酸生成減少，關鍵基因LDHA和SLC16A3表達降低。在種植窗期，孕激素水平急劇升高，激活MYC和PI3K-AKT等信號通路，進而誘導缺氧誘導因子1（HIF1A）的活化，創造缺氧環境，調節糖酵解相關酶的表達。在缺氧條件下，葡萄糖代謝從氧化磷酸化轉變為乳酸生成。然而，uRIF患者腺上皮中ALDOA等基因表達降低，進一步減少了乳酸的產生。

乳酸在調節免疫功能中的作用日益受到關注。我們的研究將子宮內膜葡萄糖代謝改變與免疫平衡聯系起來，表明腺上皮中乳酸生成增加可抑制CD8⁺T細胞的增殖和細胞因子（特別是IFNG）的產生，從而抑制胚胎免疫監視并促進植入。而uRIF患者乳酸生成不足則中斷了這一過程。乳酸可能通過誘導組蛋白H3K18乳酸化等翻譯后修飾來重塑子宮容受性。

本研究在中國四家醫院進行。招募了符合定義的RIF患者以及因男性因素不孕首次進行試管嬰兒治療的對照組女性。在種植窗期（排卵后5天）進行子宮內膜活檢取樣。樣本經過解離制備成單細胞懸液后，使用10x Genomics平臺進行單細胞RNA測序文庫構建和測序。使用Cell Ranger和Seurat軟件包進行數據處理、質量控制和下游分析。通過經典標記基因鑒定細胞類型。使用CellChat進行細胞間相互作用分析，使用scMetabolism進行單細胞代謝活性分析，使用Monocle 3進行細胞分化軌跡推斷。通過RT-qPCR、免疫組化、流式細胞術、細胞外酸化率分析以及小鼠子宮角注射模型等進行體內外驗證。統計分析使用GraphPad Prism v8進行。

本研究通過調查子宮內膜轉錄譜，闡述了uRIF的潛在發病機制，提出子宮內膜乳酸不足可能通過損害CD8⁺T細胞的免疫平衡而導致植入失敗，這為uRIF的診斷和治療提供了新的見解。