《Journal of Hazardous Materials》：Manure-Driven Antibiotic Resistance in Agroecosystems: Decadal Evidence of Accumulation Dynamics and Food Chain Transmission
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長期土壤抗生素抗性基因累積研究揭示豬糞十年施用導致特定ARGs指數增長196%-145%，其豐度與可移動遺傳元件協同富集形成持久抗性庫。通過高通量qPCR和16S rRNA測序證實，生菜根部ARGs主要源自新鮮糞便輸入而非土壤歷史累積，且未檢測到莖葉污染。該研究為評估有機肥施用風險提供新證據。
雙鵬|徐少穎|周北北|華青青|吳攀|林向貴|王一鳴
江蘇開放大學環境與生態學院，中國江蘇省南京市210036
摘要
全球對有機肥的依賴引發了人們對農業生態系統中抗生素抗性增加的擔憂。然而，抗生素抗性基因（ARGs）的長期（十年尺度）動態及其通過即食蔬菜進入食物鏈的潛在途徑仍知之甚少。本研究調查了在兩種不同施用強度下，連續10年施用豬糞后土壤中ARGs的積累情況，并評估了這些土壤ARGs和人類致病菌（HPB）向生菜的轉移情況。研究結果表明，長期施用糞肥會導致特定“累積型ARGs”在土壤中的線性或指數級積累，其總量在十年間分別增加了196%（施用量為9.0噸/公頃）和145%（施用量為4.5噸/公頃）。這種積累具有劑量依賴性，并與特定細菌宿主和可移動遺傳元件的共同富集有關，從而形成了持久的土壤抗性組。雖然生菜根部的ARGs主要來自新施用的糞肥，而非歷史上積累的土壤ARGs，但它們在莖和葉部的存在可以忽略不計。值得注意的是，在長期施用糞肥改良的土壤中種植的生菜并未顯示出致病菌負荷的增加。總體而言，本研究為理解施用糞肥的稻田土壤中抗生素抗性的演變提供了機制框架，強調了新鮮糞肥輸入而非歷史積累的土壤ARGs是導致生菜即時抗性風險的主要因素。
引言
抗生素抗性基因（ARGs）是抗生素耐藥細菌的根本驅動因素，被視為新興的環境污染物[1]。目前，在土壤、水和空氣等不同環境介質中都發現了大量耐藥細菌或基因[2]、[3]。特別是土壤，是ARGs的主要全球儲存庫[4]。關鍵的是，土壤中的ARGs可以轉移到臨床致病菌種群中[5]，并通過水或食物鏈對人類健康構成威脅[6]。
將牲畜糞肥廣泛用作有機肥料雖然有利于提高土壤肥力，但無意中也將ARGs和抗生素耐藥細菌引入了農業生態系統[7]、[8]。這些由糞肥帶來的污染物不僅增加了土壤中ARGs的多樣性和豐度[9]、[10]、[11]，而且隨著反復施用可能會持續積累[12]。此外，糞肥施用還促進了糞菌和本土土壤細菌之間的ARGs水平轉移，這一過程得益于其中所含的多種可移動遺傳元件（MGEs），如廣宿主范圍質粒和I類整合子[13]。一個關鍵但尚未解決的問題是，這是否會導致ARGs的長期積累，并最終通過即食蔬菜進入食物鏈。
目前對于施用糞肥后土壤抗性組長期演變的理解仍然零散且存在矛盾。盡管許多研究表明長期施用糞肥、堆肥糞肥或污泥后ARGs顯著富集[10]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]，但也有一些研究觀察到ARGs的積累不穩定、停滯甚至下降[19]、[20]、[21]、[22]。這些差異可能源于糞肥類型（例如豬糞與禽糞）、施用頻率、土壤類型[23]或土壤性質[24]的不同。更重要的是，大多數證據來自多年施用后的單次時間點比較，僅提供了靜態快照，無法捕捉ARGs積累或衰減的動態過程。盡管少數多年研究開始揭示ARGs豐度的逐漸增加[25]、[26]，但這些發現往往受到觀察期較短或方法學缺陷（例如使用風干的存檔土壤[26]）的限制，導致土壤抗性組的十年尺度軌跡難以量化。
至關重要的是，最終的環境和健康風險不僅取決于土壤中ARGs的積累，還取決于這些歷史上積累的ARGs及共存的HPB轉移到作物中的可能性。研究表明，施用禽糞或牛糞會顯著增加生菜根內生組織、葉內生組織和葉表面的抗生素抗性[27]、[28]。此外，糞肥來源的細菌還會影響蔬菜中的ARGs含量[29]。一些研究表明，有機施肥可以顯著提高植物組織中的ARGs水平。例如，施用糞肥的生菜中的ARGs拷貝數比化學施肥的生菜高出八倍[27]，類似地，施用雞糞后的玉米葉片中ARGs含量增加了四倍[30]。然而，現有證據仍存在矛盾且機制不明確，因為其他研究并未報告施用糞肥后蔬菜組織中ARGs含量的顯著增加[31]。大多數現有研究的局限性在于它們主要關注糞肥施用的即時效應，而植物的生長期往往與引入土壤的糞菌衰減階段重合。關鍵的是，引入的ARGs往往無法在土壤中穩定存在，富集的本土ARGs可能在幾周內恢復到基線水平[32]。這提出了一個基本問題：植物中檢測到的ARGs主要來源于新鮮糞肥輸入，還是來自歷史上積累的持久性土壤抗性組？這一區分對于風險評估至關重要，但目前尚未解決。因此，關于多年或幾十年反復施用糞肥后長期積累的土壤ARGs所帶來的傳播風險，存在明顯的知識空白。
基于2006年建立的長期田間實驗，本研究旨在解決上述知識空白。我們使用高通量定量PCR（378對引物）系統地分析了連續10年（2010-2020年）施用糞肥后農業土壤中ARGs類型和豐度的年際演變和積累模式。通過盆栽實驗結合全長16S rRNA基因測序，進一步評估了土壤ARGs向作物的轉移潛力及其相關的HPB污染風險。我們期望這項長期監測工作能為評估基于糞肥的農業生態風險提供新的視角。
實驗描述和土壤采樣
實驗在中國科學院常熟國家農業生態系統觀測與研究站（北緯31°33’，東經123°38’）進行。該實驗區域的土壤類型通常稱為稻田土，中國的土壤系統被歸類為Gleyic-Stagnic Anthrosols。該站有兩個長期施用糞肥的試驗田。試驗田1始于2006年，分別施用新鮮（F）或堆肥（C）豬糞，施用量為4.5噸/公頃（L）
長期冷凍儲存對土壤樣本中ARGs豐度無顯著影響
根據我們之前的測量結果[14]，我們選擇了和（在不同處理組間存在差異）以及（無顯著差異）進行重新測量。目的是觀察土壤和DNA樣本經過10年冷凍儲存后是否會影響初始結果。由于qPCR分析中的隨機實驗誤差（主要是由于質粒濃度變化導致的標準曲線不一致），2023年測量的16S rRNA基因和的數量
結論
本研究闡明了在連續施用豬糞條件下農業土壤中ARGs的十年尺度積累動態，并評估了它們通過即食蔬菜進入食物鏈的傳播潛力。我們的長期數據表明，糞肥施用導致特定累積型ARGs（例如多重耐藥性、消毒劑、磺胺類、MLSB、氨基糖苷類、四環素和萬古霉素抗性）的線性或指數級富集
環境意義
本研究加深了對施用糞肥的土壤中ARGs十年積累及其通過食物鏈傳播潛力的理解。結果表明，長期施用糞肥會導致特定ARGs和MGEs在農業土壤中的劑量依賴性積累。關鍵的是，ARGs/MGEs與特定細菌的協同富集形成了持久的土壤抗性組。在施用糞肥6-15年后，積累的土壤ARGs和
作者貢獻聲明
華青青：研究工作。
吳攀：研究工作。
林向貴：撰寫 – 審稿與編輯，監督。
王一鳴：撰寫 – 審稿與編輯，監督，項目管理，資金獲取，概念構思。
雙鵬：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫初稿，驗證，方法學研究，研究工作，資金獲取，概念構思。
徐少穎：研究工作，數據管理。
周北北：方法學研究，研究工作。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
本研究部分得到了江蘇省自然科學基金（BK20201110）、國家自然科學基金（41501275, 21377137, 20607024）、國家重點技術研發計劃（2023YFD1702205）以及江蘇省高校“藍色計劃”的支持。
